[发明专利]乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用

说明书

本发明属酶抑制剂的筛选方法，特别涉及的是乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法。

创制超高效低毒除草剂的首要任务是寻找先导化合物。快速，准确地发现先导化合物需要全新意义的，分子水平的离体筛选方法。选用乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，缩写ALS)做靶标，是当前国际上除草剂研究和开发的前沿热点。ALS酶抑制剂被誉为“农药科学发展史中的里程碑”。现已确认磺酰脲类，咪唑啉酮类，及三唑并嘧啶类化合物为ALS酶的抑制剂。新结构类型的ALS酶抑制剂也不断涌现。目前国内有一般的整体测定除草活性的盆栽筛选方法，该法判定筛选效果所需时间长，一般要10到14天，通过观查和手工测量给出结果。其结果误差较大，灵敏度低，而且不能有效地阐明抑制作用机理。经检索，美国专利US 5,141,870号公开了核酸碎片编码的除草抗性植物；US 5,206,135号公开了氧敏感电极测ALS酶活性。两份专利未论及ALS酶抑制剂筛选方法。国际上有的文献公开了有关酶促反应的一些资料，但也是零星的，如：①Shaner D.L.，Anderson P.C.，Plant Physiology，76，545-546(1984)植物生理学杂志②Holtzclaw W.D.，Journal of Bacteriology，121，917-922(1975)细菌学杂志③Giuseppt Forlanl，Weed Science，39，553-557(1991)杂草科学杂志文献①报导了酶促反应溶液组成和浓度，K₂HPO₄ 20mM，丙酮酸钠20mM，TPP 0.32mM，MuSO₄ 0.5mM。组成中金属离子用的是锰离子，反应结束后还需离心，除去沉淀，硫酸根的存在也影响产物的生成。文献①，②，③介绍了反应溶液的体积为0.5ml，该值较小，说明加入的各反应物更少，引起相对误差会更大，易误导抑制活性的测定结果。文献②虽给出了酶促反应时pH值和光密度E的关系，但在pH4-8范围内没有稳定的E值，无最佳pH范围会导致测定光密度E值不准确。上述资料中均未完整报导乙酰乳酸合成酶抑制剂的筛选方法，所以该方法目前在国内外公开发表的资料中还是空白。国家“八五”技攻关项目中已明确提出：“努力创建新的筛选模型”，这就是我们当前的任务。

本发明的目的是：

建立一套完整，规范，全新的分子水平离体乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法。要求该方法离开植物体，在实验室的试管中将被筛选物在乙酰乳酸合成酶的催化作用下参加反应，通过酶促反应速率下降，即产物的减少，快速，准确地计算被筛选物的抑制活性，从而筛选出乙酰乳酸合成酶的抑制剂。

本发明的又一目的是：

应用上述方法，快速，准确地确定抑制剂化合物的乙酰乳酸合成酶抑制中浓度Ic50值，从而筛选出有可能开发为高效除草剂的先导化合物。

本发明的目的是这样实现的：

1.选用质量与数量相同的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由乙酰乳酸合成酶的底物，辅酶，和缓冲液配制而成，反应过程为：