[发明专利]一种制备、分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法

权利要求书

1.一种制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于主要包括以下顺序步骤：

(1)提供禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，沙草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种含乙酰乳酸合成酶的芽和胚组织为原料，与用ALS酶的底物，辅酶，稳定剂和缓冲液配制成的均匀化溶液，在常温常压下混合搅切制成组织匀浆，其中底物用丙酮酸钠，其浓度为10-30μM，原料与均匀化溶液之比为1克：0.2-2.0ml；

(2)将组织匀浆过滤，滤渣用均匀化溶液反复浸取多次，合并滤液获得粗酶；

(3)粗酶滤液分两步离心分离，离心速度第二步高于第一步，获得离心酶；

(4)将离心酶分两步盐析富集，每步都在0-4℃温度下加入硫酸盐，饱和度为30-70％，沉淀离心30分钟，离心速度16,000-20,000转/分，获得离心酶沉淀；

(5)用ALS酶的底物，辅酶，缓冲液制成酶团溶解液溶解离心酶沉淀，获得的沉淀酶溶解液可用层析法，也可用透析反透析法纯化，由此得到高纯度的纯化酶，酶团溶解液中的底物用丙酮酸钠，其浓度为1-5mM。

2.根据权利要求1所述的制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于原料的制备是将禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种的种子在冷水中浸泡后，均匀地放在铺有潮湿细沙或锯末上放尼龙网的培养盘中，盖上纱布，在室温下发芽，刚出芽时，加盖黑布避光培养。

3.根据权利要求1所述的制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于均匀化溶液中的辅酶是选用氯化镁，硫胺素焦磷酸，和黄素腺嘌呤双核苷酸，这三种辅酶的浓度分别控制在0.3-1.0mM，0.3-1.0mM，和10-50μM范围；缓冲溶液是选用磷酸氢二钾，其浓度控制在50-150mM范围；再加入10-30％的丙三醇做稳定剂。

4.根据权利要求1所述的制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于第一步离心分离速度是6,000-8,000转/分，第二步离心分离速度是14,000-20,000转/分，每次高心时间为20分钟。

5.根据权利要求1所述的制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于盐析富集时的硫酸盐是硫酸铵，最佳饱和度是50％，所述的低温是0-4℃，沉淀离心，离心速度16,000-20,000转/分。

6.根据权利要求1所述的制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于酶团溶解液中的辅酶选用氯化镁，浓度为0.3-1.0mM；缓冲溶液选用磷酸氢二钾，浓度为30-100mM；丙酮酸钠浓度为1-5mM。

7.根据权利要求1所述的制备乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于配制的酶团溶解液可用做层析法中的淋洗液和透析法中的透析液。