[发明专利]一种制备、分离与纯化乙酰乳酸合成酶的方法

说明书

本发明涉及酶蛋白的制备，分离与纯化，特别涉及的是乙酰乳酸合成酶的制备，分离与纯化。

为建立一种新的，分子水平的离体农药筛选方法，选用乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，以下简称ALS酶)为催化剂。ALS酶是一种黄素蛋白，在国际分类法中属4，它以高度的专一性和极高的催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，并放出二氧化碳。存在于细菌或植物组织中的ALS酶，丰度低，不稳定，保存期短，国内外均无标准物销售。本发明是从植物组织中提取ALS酶。经初步检索，美国专利US5,084,086公开了除草剂对抗性作物的效果，US5,206,135公开了氧敏感电极测ALS酶活性，两份专利涉及的是ALS酶的一般性论述及除草抗性和变异方面的问题。与本发明相近似的文献有：

(1)Shaner D.L，Plant.Phyeiol，植物生理学76，545-546(1984)

(2)Giuseppe Forlanl，Weed Science杂草科学39，553-557(1991)

(3)Oda Y.，J.Gen.Microobiol，普通微生物学杂志128，1211-1216(1982)

文献(1)，(2)中与ALS酶制备，分离，纯化有关的流程和组成参数归纳如下。1)：原料均匀化溶液之比为1克∶5毫升；均匀化溶液中，假底物选用的是乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，浓度为1,000-5,000μM；磷酸氢二钾缓冲液的浓度是50mM；辅酶用的是颉氨酸，亮氨酸；盐析富集只进行一步；所用硫酸盐的饱和度为20-50％；酶团溶解液中的底物丙酮酸浓度20mM；离心分离一步，27,000转/分。从上述各参数关系反映原料与均匀化溶液比值不合理，造成匀浆中含的ALS酶少。均匀化溶液和酶团溶解液中的底物含量又过大，致使分离纯化过程中酶促反应速率加快，降低了ALS酶的质量。另外工艺流程也不尽合理，匀浆过滤后，在滤渣中还有很多酶未被提取就直接进行离心分离。一步离心分离，速度又很快，有很多粗酶含在滤渣中而被弃去。盐析富集也仅一步，又不是在最佳盐析点下工作，工艺流程不够精细。由于以上原因，造成获得的酶质量不高，正如文献(3)和其它文献零星记载的，用一般方法获得ALS酶比活值为1-2μM/mg·hr，并指出在4℃下储存24小时，与原来相比活性降低46％，还有的记载保存期仅12小时-几天，这些参数都较低，不能满足分子水平的离体农药筛选方法中生物催化剂的实用规格要求。

本发明的目的是：

应用现代分子酶学理论进行系列科学实验，从禾本科、豆科、苋科、藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科、莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中培养的乙酰乳酸合成酶在制备，分离与纯化时，优化出最适宜均匀化溶液的比例，组成，浓度及制定最佳的技术流程，获得最高比活值，最佳半衰期，最长保存期及稳定性好的ALS酶。该酶能满足新的，分子水平的离体农药筛选方法中作为生物催化剂的实用规格要求。

本发明的目的是这样实现的：

1.提供一种制备，分离与纯化乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase，缩写ALS)的方法，主要包括以下顺序步骤：

(1)提供禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，沙草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种含乙酰乳酸合成酶的芽和胚组织为原料，与用ALS酶的底物，辅酶，稳定剂和缓冲液配制成的均匀化溶液，在常温常压下混合搅切制成组织匀浆，其中底物用丙酮酸钠，其浓度为10-30μM，原料与均匀化溶液之比为1克∶0.2-2.0毫升；

(2)将组织匀浆过滤，滤渣用均匀化溶液反复浸取多次，合并滤液获得粗酶；

(3)粗酶滤液分两步离心分离，离心速度第二步高于第一步，获得高心酶；

(4)将离心酶分两步盐析富集，每步都在低温下加入硫酸盐，饱和度为30-70％，沉淀离心30分钟，离心速度16,000-20,000转/分，获得离心酶沉淀；

(5)用ALS酶的底物，辅酶，缓冲液制成酶团溶解液溶解离心酶沉淀，获得的沉淀酶溶解液可用层析法，也可用透析反透析法纯化，由此得到高纯度的纯化酶，酶团溶解液中的底物用丙酮酸钠，其浓度为1-5mM。

2.原料的制备是将禾本科，豆科，苋科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，锦葵科，泽泻科植物中任意一种的种子在冷水中浸泡后，均匀地放在铺有潮湿细沙或锯末上放尼龙网的培养盘中，盖上纱布，在室温下发芽，刚出芽时，加盖黑布避光培养。