[发明专利]一种检测7S胶原的方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及人类医学卫生，特别是一种检测人的血清、体液或组织匀浆的7S胶原(7S collagen，简称7S)的方法。

肝病是一种常见病。尽管血清谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶同工酶、色素排泄试验等能够相对特异性地提示肝病的的存在，却各有其局限性。因此，寻找能够灵敏地反映肝病程度、能够随慢性肝炎→肝纤维化→肝硬化甚至肝癌这一病程演变而反映正常结构逐步丧失的指标仍为临床所急需。近年认为7S胶原在反映肝纤维化上优于常规肝功能指标及部分商品化的血清N端III型胶原末端肽检测(AIa-KoKKo等：Hepatology 1992，16：167-172；Yamada等：Clinica Chimica Acta 1992，212：73-78)。7S胶原检测在国外已摸索多年，但均难以商品化，而仅限于供实验室科研用。主要症结在于如下四个方面：一是7S胶原提取纯化较困难；二是7S胶原较难保存。尤其是碘标记7S胶原，在标记前与标记后均需加入一定的保护剂，方可维持其活性；三是放免分析过程中，碘标及竞争抑制反应条件要求高；四是特异性兔抗人7S胶原血清制备不易，这主要是与抗原的免疫原性低，家兔免疫反应性差及与其他型胶原及层粘连蛋白交叉反应性高等有关。

近年发现，7S胶原主要在肝贮脂细胞、内皮细胞中产生，在巨噬细胞及多形核白细胞中降解(Kamagath等：J B：ol Chem 1992，33：23753-23758)。肝病肝纤维化时，血清7S胶原因产生过多与降解产物增多而升高。其升高程度随慢性肝炎病程进程及纤维化程度而逐步加剧。7S胶原被认为在反映肝纤维化上优于目前现有的指标。由于7S胶原及IV型原胶(基底膜成份)的降解片段，所以7S胶原同时反映肝纤维化时胶原降解情况。富含血管基底膜成份的组织器官病变亦可出现7S胶原异常，如甲状腺机能亢进，中晚期糖尿病、硬皮病等(Shima等：Clin Chem 1992；38：1843-1846；Yamadaa等：Clin Chem 1992；25：467-470)

本发明的目的是提供一种新型的检测7S胶原的方法及其试剂盒，可灵敏、准确、快速地对纳克/毫升(ng/ml)水平的7S胶原进行定量检测。

本方法提供的检测7S胶原的方法，是基于平衡法原理在未知7胶原含量的标本中加入一定量抗7S胶原特异血清，再加入碘标记7S胶原(¹²⁵I-7S)，使之与标本反应所剩的7S胶原结合，用第一抗体即兔抗人7S胶原血清、再用第二抗体即羊抗兔血清将7S胶原沉淀下来，测其放射活性抗。7S胶原血清所结合的¹²⁵I-7S胶原与标本中7S胶原含量呈负相关关系，用7S胶原标准品同步对比操作作出放射性浓度标准曲线，通过SN-682B电脑γ计数器的软件即可获得待测标本的浓度值。

本发明的具体操作程序为：

1、向各塑料放免试管中加入恒量兔抗人7S胶原血清；

2、分别加入等体积7S胶原标准品或待测标本，混匀，4℃冰箱内过夜；

3、加入恒量碘标记7S胶原(¹²⁵I-7S)，混匀，4℃冰箱，1.0小时；

4、加入恒量第二抗体即羊抗兔血清(固相)，混匀，4℃，1.0-2.0小时；

5、在3000转/分离心操作15分钟，弃上清，测沉淀物(即¹²⁵I-7S胶原-抗体复合物)放射性；

6、将测定的7S胶原标准品各浓度管(0、20、40、80、160、320、640ng/ml)放射性的比值B/BO作出B/BO浓度标准曲线，计测待测标本B/BO值，或通过SN-682B电脑γ计数器软件得出标本浓度值。

本发明采用有限胃蛋白酶消化、中性盐反复沉淀、胶原酶消化、用Pharmacia Sephacryl S-300、分子筛柱层析(已往多用Agrose A 5m)制备出高纯度的7S胶原，解决了7S胶原标准品，具有更高的纯度与活性。其具体制备步骤为：

(1)在酸性条件下用胃蛋白酶有限消化法自人胎盘中粗提出各型胶原成份(I、III、IV、V、VI型混合胶原)；

(2)运用酸性及中性条件下不同氯化钠浓度逐级反复沉淀、分离IV型胶原，获得IV型胶原粗制品；

(3)将粗制IV型胶原经DEAE52柱层析后，采用粗制细菌性胶原酶20℃消化20小时，然后经Sephacryl S-300分子筛柱层析，第二洗脱峰即为7S胶原；

(4)将7S胶原用0.1mol/L醋酸透析，冰冻干燥，-40℃冻存。

本发明的发明人首先设计的新型7S胶原检测试剂盒其组成试剂如下：