[发明专利]DNA分离、分级分离和分析方法及其系统

说明书

本发明涉及样品制备方法，DNA分析方法及其用于DNA序列测定或DNA分析的分离、分级分离和分析方法的系统。

为了按照常规方法测定长的DNA序列，将靶DNA克隆在载体如质粒中，从而经培养而增加有广泛用途的DNA拷贝数目。为了测定所说DNA(在本文中为2—6升碱基)，(1)用限制性酶将DNA消化成较小的片段，(2)再克隆(亚克隆)后将其感染到大肠杆菌中，以及(3)将所说的大肠杆菌培养成菌落。然后经菌落筛选来分级分离DNA片段。培养增殖所选择的菌落中的大肠杆菌并提取DNA以得到包埋于质粒中之靶DNA的许多拷贝。也就是说，用限制性酶消化DNA以通过亚克隆和继后的菌落培养来纯化、分级分离和扩增DNA。如上所述，在琼脂上培养大肠杆菌以形成菌落。各菌落包含有携带质粒的大肠杆菌，质粒中则含有DNA片段的单一拷贝。从各菌落中挑取大肠杆菌并培养在试管中以增加拷贝数目。然后提取DNA用作进行序列测定的样品。为了分析各种不同的DNA片段，分析得自各不同种之菌落的DNA片段。因为有反复分析含同一DNA片段之菌落的情况，所以分析过程冗长而且常常使菌落的数目平均为不同种DNA片段数目的4倍左右。

使用这样的亚克隆方法进行DNA制备可使DNA片段在一个过程中得以分离和扩增。尽管有这一优点，但该方法也有花费过多时间和劳动，并且不适于自动化操作的缺点。此外，其另一个缺点是必须重复分析同一DNA片段，因为预先不可能知道在各菌落的大肠杆菌中含有何种DNA片段。

本发明的目的是解决现有技术的所说的问题，并提供没有使用克隆和培养的DNA分级分离、增殖和分析方法，从而取代耗费时间和不适于自动化的亚克隆及培养方法。

为了实现所说的目的，本发明使DNA片段与配有3’末端侧有选择DNA片段之序列的1至3个碱基的DNA探针间发生杂交；从而，可根据是否发生探针DNA链延伸反应来确定可用作测定各DNA序列之引物的DNA探针。本发明包括使用所说的方法对DNA片段进行分级分离的方法。本文所用的术语DNA与常规定义几乎没有区别。两个或多个DNA探针的大部分序列都是一样的，只是3’末端侧的1至3个碱基不同。目的是观察是否存在互补链延伸，是否有杂交。必要时用PCR方法(聚合酶链反应)扩增DNA片段，并与所说的新建立的方法平行进行，经凝胶电泳按照DNA片段的长度进行分离和分级分离，从而完成DNA分析。