[发明专利]转染动物细胞的重组DNA病毒载体

说明书

本发明涉及转染动物细胞的重组DNA病毒载体。更具体地讲，本发明涉及含重组酶基因或编码重组酶识别序列之DNA序列的重组DNA病毒载体，用所述载体向动物细胞中转导外源基因的方法，及其在基因治疗中的用途。

经常使用逆转录病毒作为基因转导的病毒载体。但是逆转录病毒只转染有丝分裂细胞，并整合在宿主细胞的染色体中，因此，逆转录病毒作为病毒载体遇到了安全性问题，特别是在基因治疗中。因此人们认为应限制使用逆转录病毒作为病毒载体。

腺病毒有许多优势，如在许多种动物培养细胞中转导效率几乎为100％，不像逆转录病毒，它没有整合入染色体中的阳性机制，甚至可以向静止细胞转导基因。由于这些优点，腺病毒被认为可应用于进行外源基因转导的极广泛的领域中。在不久的将来将确立腺病毒载体用作基因治疗的主要技术之一。

腺病毒载体已广泛用作一种基因治疗技术或用于对高度分化细胞如神经系统细胞中表达的研究。对于基因治疗技术，已广泛研究了体内基因治疗，其中通过向细胞所存在的组织中直接注射基因，将在活细胞中有缺陷的基因转入细胞中。在美国，已允许五个研究机构进行用基因治疗方法治疗囊性纤维变性病人的临床试验。而且，基因治疗的研究已扩展到了肌肉营养不良、高脂蛋白血(II型)、和脑瘤。另一方面，腺病毒载体使得甚至能向静止细胞中转导基因。因此，在进行向初级培养细胞或动物体转导基因的试验时，已应用了腺病毒载体向分化细胞，特别是向神经系统细胞中转导基因。

鉴于上述原因，人们特别希望腺病毒载体能实际应用于特别是基因治疗中，因为此载体能使基因在直接注射或施于动物体内时表达，并能向各种分化和未分化细胞(包括神经系统细胞)中转导基因。

但不像逆转录病毒，腺病毒载体缺少向染色体中整合的阳性机制，结果在此载体中基因的表达只是暂时的。即，表达仅持续少数几周，至多约2个月。因此，当要保持治疗效果时，为了持续表达应重复注射或施用此载体。但重复注射或施用可能会诱导产生减低疗效的抗体。

因此，本发明的目的是提供一种重组腺病毒载体系统，其中通过腺病毒载体将外源基因转入动物细胞，然后转化成一种能够在此细胞中自主复制的形式。本发明的另一目的是提供用于基因治疗的这种系统。

为了达到上述目的，本发明者进行了广泛的研究，并成功地得到了一种重组腺病毒载体系统：

其中用腺病毒载体将带有外源基因的表达单元转入细胞中，然后利用重组酶基因和重组酶识别序列将其转化成环形DNA分子，和

其中已向这样形成的环形DNA分子中引入了复制起点，从而带有外源基因的表达单元能够自主复制以在此细胞中连续表达外源基因。

本文中，“重组酶”指特异的重组DNA酶，它能够识别由几十个碱基对组成的特异DNA序列并裂解该序列，能够改变由这种裂解形成的DNA片段并将这种片断连接形成新的DNA序列。因此，同时构建了一个表达重组酶的重组腺病毒载体和一个在相同方向具有两个拷贝重组酶识别序列的重组腺病毒载体，这两个载体共转染到细胞中，其中重组酶在载体中表达以裂解另一载体中的两个重组酶识别序列，然后从存在于两个重组酶识别序列之间并已被重组酶从载体中切下的DNA片断重建，形成环形DNA分子。因此，这样的DNA片段具有外源基因的表达单元和复制起点，当它转化成环形DNA分子后就可自主复制并永恒保持在转导的细胞中连续表达外源基因。这样，如果将这种重组腺病毒载体系统应用于基因治疗中，一次注射或施用这种载体能够在长时间内保持疗效。

基于这些新发现，进行了进一步研究完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种转染动物细胞的重组DNA病毒载体(1)，它包括启动子、重组酶基因和poly(A)序列。

本发明的另一目的是提供一种按照上述载体(1)的重组DNA病毒载体(2)，其中所述DNA病毒载体为腺病毒载体。

再者，本发明的另一目的是提供一种按照上述载体(2)的重组DNA病毒载体(3)，其中所述重组酶基因是得自E.Coli P1噬菌体的重组酶Cre基因。

再者，本发明的另一目的是提供一种转染动物细胞的重组DNA病毒载体(4)，它包括两个重组酶识别序列、在动物细胞中可操作的复制起点、启动子、外源基因和poly(A)序列，所述复制起点、启动子、外源基因和poly(A)序列都位于两个重组酶识别序列之间。

再者，本发明的另一目的是提供一种按照上述载体(4)的重组DNA病毒载体(5)，其中所述DNA病毒载体为腺病毒载体。