[发明专利]幼龄动物胸腺生长因子及其提取分离方法

说明书

本发明涉及从健康的幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)新鲜胸腺中提取具有生物活性的中小分子胸腺蛋白混合物，即胸腺生长因子，其分子量＜60KD；本发明还涉及从健康的幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)胸腺中提取其胸腺生长因子的提取分离方法。

胸腺是机体的中枢免疫器官，是T细胞发育分化的场所，胸腺中有免疫增强作用的多种激素和免疫抑制作用的因子，这两类功能相对立的因子，共同担负着机体细胞免疫功能的调节作用。因此，分离纯化胸腺中各种因子具有十分重要的临床意义。    

动物胸腺特别是幼龄动物胸腺生长因子能明显促进成纤维细胞，内皮细胸的增殖，对胃溃疡有明显的促愈合作用，在治疗消化性溃汤方面，可以取得疗程短，愈合率高，复发率低的良好效果，在消化性溃疡治疗及创伤愈合方面具有良好的临床应用、开发前景。

本发明目的在于应上述临床应用、开发前景的需要，提供一种从幼龄动物胸腺中提取分离出动物胸腺生长因子的提取分离方法及动物胸腺生长因子。

本发明提供的从幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)胸腺中提取分离动物胸腺生长因子的提取分离方法如下：

1、提取：

取健康幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)的新鲜胸腺(离体6小时之内)磨碎成匀浆，经FP2000型分离桂分离(西德产，分子量6万以下)，收集分离外液，浓缩冻干成幼龄动物胸腺生长因子干粉。

在选材过程中，发现胸腺有包囊或结节、质地粗糙、色泽不正常或有异常气味及离体超过6小时者均不符合选材的质量要求。

2、分离纯化：

将上述幼龄动物胸腺生长因子冻干粉(蛋白浓度为15-20mg/ml)的水溶液，使用Pharmacia快速蛋白液相色谱仪(FPLC，LCC-500，P-500泵，MV-7进样器，UV280nm检测系统，0.5AuFs，阴离子交换柱MonoQHR5/5)对其幼龄动物胸腺生长因子冻干粉(蛋白浓度为15-20mg/ml的水溶液)进行纯化，加样量0.5ml/次，NaCl非线性梯度洗脱。洗脱A液：20mmol/L，Tris-Hle，pH8.0。洗脱B液：20mmol/l Teis-Hle，1.0mol/L，NaCl，pH8.0，洗脱速度为：1ml/min，使B液在0-60％之间为线性梯度，运行22min，B液在100％时洗脱5min，整个洗脱在32min完成，在280mm紫外检测进行峰收集，每个峰作为一组份收集，分别收集各洗脱峰，收集的样品用双蒸水透析(18-24h)去盐，低温干燥，最好是真空冷冻干燥。

在紫外监测系统的监测下，整个洗脱过程共洗脱出和收集到9个组份吸收峰(分别称为W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9)。

然后将各组份峰进行PAGE凝胶电泳，促细胞增殖活性等项测定。

GradiFrac^TM柱层析系统分离纯化图谱见图1。

经GradiFrac^TM纯化后各组份峰与促细胞增殖效应的关系测定：

(一)SWiss3T3细胞[H³]-TdR掺入法测定各组份活性：

1、方法：传代SWiss 3T3细胞经0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种到48孔培养板(Costa公司产品)中，每孔接种5×10⁴细胞，20小时后更换无血清培养液(DDED培养液内含15mM HEPES，33.3mM葡萄糖，5mg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，0.02％牛血清白蛋白)，继续培养24小时，加稀释好的不同样品，使每个样品终浓度皆为12.5μg/ml，同时加[³H]-TdR(终浓度为1μCi/ml)，37℃，5％CO₂继续培养，36小时后去掉培养介质，PBS洗二次，加甲醇固定二次，每次10min，水洗3次后，加5％三氯醋酸固定二次，再水洗三次，然后加入0.5N NaoH溶解细胞，点膜后，红外灯下烤下，加入闪烁液，液闪测定。

2、结果：经GradiFrac^TM纯化后的9个组份峰和提取物原液的活性测定结果见表1、图2。