[发明专利]定点诱变的方法

说明书

本发明涉及基因工程领域使用的定点诱变的简化方法以及用于此方法的试剂盒。

近年来，定点诱变已成为阐明基因工程领域克隆基因的结构和功能之间关系所必不可少的技术。在蛋白质工程领域，定点诱变也是修饰蛋白质以改变其特性所必不可少的技术。

例如，常规下定点诱变可按下列步骤进行。

(1)将需要引入定向突变的DNA插入载体。对于双链质粒DNA而言，还需通过热变性分离互补链，或者也可以使用M13噬菌体载体以得到单链DNA。

(2)将依据定向突变化学合成的寡核苷酸与上述单链DNA一起退火，再经受聚合酶反应和连接酶反应以得到除定向突变处以外皆为互补的双链DNA。

(3)用上述DNA转化大肠杆菌(Escherichia coli)并筛选出其中引入突变的菌落。

这种定点诱变法需要复杂而麻烦的步骤。

另外，已知的几个蛋白质可催化链交换反应。在这些蛋白质中，对来源于大肠杆菌、被称作RecA的蛋白质的特性进行了详细研究，并尝试将此RecA蛋白质用于诱变[Tanpakushitsu.Kakusan.Koso(Protein，Nucleic Acid and Enzyme).32(1)，73～14(1987)]。但在此方法中，不是直接通过链交换反应而是随机地通过诱变剂处理来引入突变。因此很难将突变引入确定的位点，此方法因此也不能被当作定点诱变。

本发明的目的是提供定点诱变的简化方法以及实施此方法的试剂盒。

本发明第一方面涉及包括以下步骤的定点诱变的方法：

(1)在体外用能催化链交换反应的蛋白质处理含有定点诱变靶DNA的载体以及诱变DNA，由此可制得其中已通过链交换反应引入突变的载体；和

(2)将其中已引入突变的载体引入宿主细胞。

本发明第二方面涉及定点诱变的试剂盒，它包含能催化链交换反应的蛋白质。

本发明将在下文详细描述。

例如，根据本发明方法的定点诱变可按下列方法进行。

(1)在体外用能催化链交换反应的蛋白质处理已插入定点诱变靶DNA的载体以及诱变DNA以诱导同源重组。

(2)将上述(1)中制得的载体引入宿主细胞。在此步骤中，优选使用选择压力以避免筛选出未引入突变的载体。

(3)通过提取载体可得到已引入突变的DNA。如有必要，可将提取出的载体再引入适当宿主以得到必定已引入了突变的DNA。

用作诱变靶子的DNA无需作特别限制，只要它在宿主细胞中不产生致死活性。当载体是双链时，诱变DNA(单链)和载体使用的摩尔比约为1∶2。

能催化链交换反应的蛋白质的典型例子当推来源于大肠杆菌的RecA蛋白质。然而本发明并不局限于此，也即本文中还可使用类似于RecA但为其它来源及其变异体的蛋白质。其它来源蛋白质的例子是来源于裂殖酵母的Rad 51基因产物。已克隆了鼠和人类的类似基因，这些基因的产物也可使用。当使用RecA蛋白质引入突变时，反应可在含有镁盐，如醋酸镁或氯化镁，和腺苷三磷酸(ATP)的，如Tris-HCl或者HEPES的缓冲液中进行。例如，优选的反应介质所具有的组分包括25mM Tris-HCl(或Tris醋酸)(pH7.5)、10mMMgCl₂、1mM DTT和1mM ATP，或者含有30mM HEPES(pH7.2)、15mM醋酸镁、2mM DTT、1.2mM ATP和100μg/ml BSA。此时，所使用的RecA蛋白质的浓度应能有效地允许链交换反应得以进行。例如，当载体是双链时，载体和蛋白质可使用的浓度分别约为2.5至20μM和5至40μM。

反应介质可进一步含有ATP再生系统，例如可含有8mM磷酸肌酸和10U/ml肌酸磷酸激酶。此时，该蛋白质的量可减少为约2μM。

将除该蛋白质以外的成分混合，预热此混合物，在其中加入该蛋白质并在37℃下温育此反应混合物1至2小时以进行链交换反应。

在步骤(2)中所使用的宿主细胞的例子包括已建立了宿主-载体系统的细胞，即如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的细菌、酵母菌、真菌、植物细胞和动物细胞。从方便操作的观点出发可优选使用大肠杆菌。尽管大肠杆菌的任何菌株都可不受限制地被使用，但更优选使用具有mut S突变的菌株，如BMH 71-18 mutS菌株。也可使用其它错配修复系统缺陷的菌株，如mut T或mut D。