[发明专利]含有EB病毒壳蛋白gp125基因工程菌株的建立及其应用

权利要求书

1、一种含有EB病毒壳蛋白gp125基因的工程菌株，其特征在于壳蛋白基因的构建及在原核系统中的表达为：

(1)EB病毒基因组BamHI酶解的A片全长11000多个碱基对，它被克隆在质粒pBR322中，其克隆过程如下：

用内切酶BamHI/EcoRI从A片中获得5200bp一段DNA，含gp125全部基因，利用这段DNA上的两个XhoI酶位点和两点之间的pst-1酶，获得约1000bp XhoI/pst-1区段，含gp125全基因中段的三分之一以上序列；

(2)将上述基因插入puc载体，puc系统是大肠杆菌质粒，能在大肠杆菌中独立复制，其中的启动子能使其下游插入的三联密码相匹配的外来DNA编码相应的蛋白，将分离得到的XhoI/pst-1基因插入puc载体启动子下游的HincII/pst-1位点，即用HincII/pst-1酶将环状的puc质粒DNA切成直线状，再用T₄DNA连接酶将XhoI/pst-1 DNA连接在质粒DNA的切口上，使成重组的环状DNA，将其转染进入经氯化钙处理过的大肠杆菌，在选择培养基上能存活的细菌即含重组的DNA，获得的细菌株低温保存。

2、一种含有EB病毒壳蛋白基因gp125的工程菌株，其特征在于壳蛋白基因的构建及在真核系统中的表达为：

以痘苗病毒为载体表达gp125全基因，首先构建转移载体，转移载体包括：(1)能在细菌中独立复制的区段；(2)痘苗病毒的启动子及启动子下游的接头，供外源目的基因插入；(3)痘苗病毒的一段序列分成两段分别存在于启动子和克隆位点的左右两侧，形成框架(flank)；(4)分离gp125基因，插入痘苗病毒启动子下游，其操作过程是：痘苗病毒7.5K启动子插入位点来自质粒pGS20从pGS20分离一个EcoRI片段DNA，插入PJ11质粒，在PJ11中含痘苗病毒核酸的一段非必须区，组成PJ7.5作为克隆外源目的基因载体。BALF₄基因的分离：利用ATG前方6bp处的MnLI酶位点，先分离200bp一段DNA，插入PuC质粒HincII位点，再利用此片段中的单一MLuI酶位点及puc上的HindIII位点，克隆其余的BALF₄基因序列，并使BALF₄基因两侧各有一个BamHI位点，将其插入PJ7.5载体启动子下游.转移载体PJ7.5/BALF₄含gp125全基因，启动此基因的启动子及重组入痘苗病毒核酸的一段同源序列；

重组病毒的获得：转移载体DNA在细胞中经同源重组将目的基因携带入病毒核酸，子代病毒的核酸中含有gp125基因，即重组的病毒具有了新的生物学性状，在细胞中表达gp125蛋白，其主要过程是真核细胞用痘苗病毒感染，在病毒核酸复制期，将转移载体DNA转染进入细胞，经核酸杂交方法或以胸腺嘧啶激酶作为选择标志，从正常的痘苗病毒子代中选出重组的病毒；

用重组病毒感染细胞，在胞浆内产生大量的gp125；纯化抗原，用于ELISA，重组病毒感染的细胞，经低渗液膨胀，超声波裂解，高速离心的上清液再经DEAE-Sepharose ff纯化。

3、根据权利要求2所述的含有EB病毒壳蛋白基因gp125的工程菌株，其特征在于壳蛋白基因的构建及在真核系统中的表达为：

以昆虫杆状病毒为载体表达gp125全基因，将BALF₄基因(含BamHI接头)直接插入昆虫杆状病毒载体pVL941，含昆虫杆状病毒多角体蛋白启动子及多角体蛋白基因，作为同源重组序列；构建成转移载体pVL941/BALF₄，用此质粒DNA与昆虫杆状病毒DNA共转染昆虫细胞sf9，从子代病毒中筛选出表达核多角体蛋白阴性的病毒。

4、一种用工程菌表达的EB病毒壳蛋白gp125基因作为诊断抗原在疾病诊断中的应用，对于原核，将低温下保存的菌种接种在细菌培养液中，即可获得任意需要量的细菌，从中提取所需要的蛋白，低温保存的菌种涂于细菌培养皿，单个菌落在5ml LB培养液中摇过夜，次日放大至100ml，37℃摇3-4小时，1mMIPTG诱导3小时，5000rpm收集细菌菌体，经0.5％Trifon x100裂解液悬成悬液，超声波处理；高速离心获包函体沉淀，经4M脲清洗，再溶解包函体于8M脲，进一步用DEAE-Sepharose FF氯化钠梯度纯化，获活性蛋白峰；在真核表达系统中，用重组痘苗病毒或昆虫杆状病毒感染细胞，从中提取所需要的蛋白，重组病毒感染的细胞经高渗溶液处理，超声波裂解，再经DEAE-Sepharose ff层析，其蛋白活性峰用于诊断抗原，作为诊断使用时，将基因工程表达的蛋白结合于塑料板孔中，再将待检血清加入该板孔中，37℃孵育30分钟以上，洗去血清，加酶或金标记抗体，37℃再孵育30分钟以上，然后加酶底物显色或直接以红色的金颗粒判定结果。