[发明专利]含有EB病毒壳蛋白gp125基因工程菌株的建立及其应用

说明书

EB病毒(Epstein-Barr Virus)是一种对人致病的病毒，可以引起传染性单核细胞增多症、鼻咽癌和多种淋巴病，其中鼻咽癌在我国南方数省具有较高的发病率，在各种恶性肿瘤中占第一位。在EB病毒感染的人和鼻咽癌患者血清中存在一种抗体，这种抗体是特异性地针对EB病毒感染和是否患鼻咽癌(NPC)。在NPC高发区，进行人群普查，甚至可以在发病前数年，检查出血清中的抗体。我国在EB病毒感染和NPC的血清诊断方面一直使用国内外从70年代沿用至今的检查抗体的方法。即将带EB病毒的肿瘤细胞涂在玻璃片上，涂片前，要用肿瘤激活因子激活细胞，增加细胞中病毒壳蛋白的含量，然后经丙酮固定细胞，在细胞片上加上人血清，结合后，洗去未结合的血清，再加标记物，最后用显微镜检查细胞中是否有与抗原结合的血清抗体。该方法存在的缺陷是：(1)自然产生EB病毒壳蛋白的细胞株，培养困难，而且肿瘤细胞及肿瘤病毒对环境和操作者是一种危害；(2)产生抗原的细胞仅占总细胞数的10％，而这些产生抗原的细胞中又仅有极低量的有效成分，直接影响检查方法的敏感性；(3)这种肿瘤细胞带有多种EB病毒特有的蛋白，人血清中也存在对不同蛋白的抗体，因此，影响了检查EB病毒壳抗体的特异性；(4)检查方法繁琐，试想面对数万人普查和追踪数年，用显微镜逐个观察，人力、物力都是不可能的，因此限制了普查和追踪的范围。对一种检查方法好坏的评价，关键是敏感性，特异性和简便程度。

EB病毒基因组(genome)的DNA序列于1984年发表(Bear，R.等人DNA Sequence and expression of theB95-8 Epstein-Barr genome.Nature(Landon)310：207-211，1984)。1985年Pearson等人首先证明EB病毒壳蛋白能用于检查传染性单核细胞增多症病人血清中抗体，并且用于鼻咽癌的诊断(Pearson G.R；J.Immunology of EBV-assoiated Cancer.TheHerpesviruses Vol.4 P183-199，Plenum press，NewYork，1985)。产生壳蛋白的基因称BALF₄，即病毒全基因组经内切酶BamHI切割后，在最大的一片A片段中，向左转录的第四个开放读码序列所表达的蛋白。壳蛋白gp125是病毒感染后的主要免疫源，经分离纯化的gp125用于疾病的诊断。Luke等人从自然产生EB病毒的肿瘤细胞株，B95-8细胞中提取了gp125，作为抗原，用于诊断，并与B95-8细胞涂片方法比较，证明了用纯化的gp125检查抗体，更为敏感和特异。相继，在国外的一些报道中均提出了这样一个方向，必须用基因工程方法，大量表达gp125，为EB病毒感染和鼻咽癌的诊断提供有效的切实可行的手段，即敏感性强，特异性好，简便易操作和经济实惠。而从B95-8细胞中获gp125，方法繁琐，昂贵，而且自然表达量低，不可能获得可应用的量，纯化方法及大量细胞培养带来的困难和不安全因素无法克服，只能是实验室中的探索，但为基因工程方法表达gp125抗原提供了很好的依据(Pearson.G.R.J.VirologicalMethods 21：97，1988，Dolken，G等人，J.Immunological Methods 68：331，1984，Uen，w-cetalInt.J.Cancer 41：479，1988)。随着分子生物学技术的发展，用基因工程手段表达某种特定的，单一的成分用于诊断是当今世界上诊断领域的重要进展，特别是对尚不能人工培养的病毒，必须用基因工程抗原作为诊断。

本发明的目的在于建立一种含有EB病毒壳蛋白gp125基因的工程菌株，和用此工程菌表达的EB病毒壳蛋白作为诊断抗原用于疾病的诊断。

本发明是从分离gp125基因开始，相继在原核和真核系统中表达这段基因，证明了其表达产物的特点，即与天然的gp125相似的免疫反应，并且建立了能用于实际应用的诊断方法。

BALF₄基因近3000碱基对(bp)，在构建全基因的同时，首先用大肠杆菌表达了BALF₄的部分序列，以证明其产物的可使用性，然后再将全基因分别以痘苗病毒、昆虫杆状病毒为载体在真核细胞中表达全部BALF₄基因。昆虫杆状病毒是近几年发展起来的新的载体，表达量高于痘苗病毒载体，因此在用痘苗病毒为载体表达的基础上，又以昆虫杆状病毒为载体，在昆虫细胞中更高效表达gp125，为实际应用提供更大量的抗原。