[发明专利]纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法

权利要求书

1、一种从重组生物体细胞中纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，所述的方法包括以下步骤：

(a)用含离液盐的缓冲液破碎细胞以获得细胞匀浆；

(b)向步骤(a)的细胞匀浆中加入表面活性剂以从细胞的细胞膜中抽提表面抗原；

(c)碱化步骤(b)中得到的抽提物以增加抽提物中表面抗原的溶解度并促进形成表面抗原颗粒；

(d)酸化经步骤(c)处理的抽提物然后离心沉淀并除去抽提物中的细胞碎片、脂类和杂蛋白，获得合表面抗原的溶液；

(e)将步骤(d)中得到的溶液与二氧化硅接触以将表面抗原吸附到二氧化硅上，洗去杂蛋白，并用缓冲液将表面抗原从二氧化硅上脱附，获得纯化的表面抗原组分；

(f)将步骤(e)中得到的纯化的表面抗原组分进行疏水柱层析，获得合表面抗原的组分；以及

(g)通过大小排阻凝胶过滤层析纯化步骤(r)中得到的组分，获得纯化形式的表面抗原。

2、如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的离液盐选自由硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、盐酸胍和尿素组成的一组。

3、如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的缓冲液中离液盐的浓度为1-8M。

4、如权利要求1所述的方法，进一步包括如下步骤：向步骤(b)或(c)中得到的细胞抽提物中加入硫酸钠或硫酸铵至浓度为8-15％(w/v)；除去细胞碎片和杂质；在步骤(d)之前将上清液进行渗滤。

5、如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中使用的表面活性剂是吐温20、吐温80、Triton x-100或脱氧胆酸钠。

6、如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中使用的表面活性剂的浓度以细胞匀浆的体积计为0.1-0.5％(w/V)。

7、如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中得到的细胞抽提物的pH在步骤(c)中被调至11.0-13.5。

8、如权利要求1所述的方法，其中细胞抽提物的pH在步骤(d)中被调至4.5-6.0。

9、如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中使用的二氧化硅的表面积为100-500m2/g。

10、如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中，使用pH为8.8-11.0的、含有1-8M尿素和0.1-0.3％(重)表面活性剂的缓冲液将表面抗原从二氧化硅上脱附。

11、如权利要求10所述的方法，其中所述的表面活性剂为脱氧胆酸钠。

12、如权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中的疏水性树脂为具有苯基的琼脂糖凝胶。

13、如权利要求1所述的方法，其中步骤(f)中的疏水柱层析是如下进行的：将合表面抗原的组分通过用pH为8.8-11.0并含有1-4M尿素的平衡缓冲液平衡的柱；用合10-40％(重)乙二醇的平衡缓冲液洗柱；以及用合60-80％(重)乙二醇的平衡缓冲液洗脱表面抗原。

14、如权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中的大小排阻层析是通过用分子量截断值至少为1,000,000的葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶进行的。

15、如权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中的大小排阻层析是如下进行的：将含表面抗原的组分通过用pH为6-8并含0.1-0.2M氯化钠的Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液平衡的柱；以及用相同的缓冲液洗脱表面抗原。

16、含有根据权利要求1所述而纯化的表面抗原的乙型肝炎病毒疫苗。