[发明专利]纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法

说明书

本发明涉及纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，更具体地，涉及从重组酵母细胞纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，所述的方法包括一个细胞破碎步骤，该步骤中通过使用离液盐而防止preS2肽的损失，接着进行抽提、沉淀、二氧化硅吸附以及柱层析。

乙型肝炎是一种世界范围的公众健康问题并据称世界人口中约有2-3亿人携带乙型肝炎病毒(HBV)。HBV感染通常会引发肝硬化和肝细胞癌，可能会使患者死亡。

到目前未止尚未开发出乙型肝炎的治疗剂，因此疫苗的重要性就更加强了。

1955年Blumberg等从乙型肝炎患者的血中发现了澳大利亚抗原；1971年Krugman等报道了使用热处理的含HBV的人血清的活性免疫方法，从而提供了开发乙型肝炎疫苗的可能性。从那以后，通过从乙型肝炎患者的血浆中分离并纯化乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)而制备的第一代乙型肝炎疫苗已经商品化(M.R.Hilleman等，Develop.Bio.Standard，54，3-12(1983))。

然而从血浆制得的疫苗存在以下问题：它们的纯化和失活过程很复杂并且费用很高；人血供应有限；接种者有可能被血源中的病原感染。

因此，为解决上述问题已尝试使用遗传工程手段开发乙型肝炎疫苗。

例如，Valenzuela等开发了一种在酵母中生产HBsAg的方法(Nature，293，347-350(1982))。这种重组HBsAg(r-HBsAg)主要由具有226个氨基酸的S蛋白(P25)组成，并且当其纯化时会形成与那些从血浆中分离出的HBsAg几乎相同的表面抗原颗粒。

K.H.Heermann等报道乙型肝炎包膜蛋白含有大量的L-蛋白(preS1+preS2+S：P39)、M-蛋白(preS2+S：P31)以及S-蛋白(J.Virol.，Nov.396-402(1984))。已知preS1肽在人体感染乙型肝炎病毒后对于杀灭肝上的乙型肝炎病毒有重要作用。preS2肽由55个氨基酸组成，在动物实验中已证实其帮助形成抗表面抗原的抗体(D.R.Milich等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，8168-8172(1985))。

另外，已知形成的抗preS2肽的抗体表现出对病毒感染的防御活性(Y.Ito等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，9174-9178(1986))。因此，含preS2肽的疫苗可能对不能形成抗预先已存在的表面抗原的抗体的人是有用的。这种疫苗的开发对于保护不受新近发现的乙型肝炎病毒变种的感染也是很重要的。

但是由于preS肽对存在于酵母细胞中的蛋白酶非常敏感，所以制备含preS肽的乙型肝炎病毒表面抗原遇到了各种困难。为克服这些困难，Kobayashi等生产了一种疫苗，其是通过对preS2和S肽之间的蛋白酶敏感区进行遗传修饰而制备的(J.Bacteriology，8，1-22(1988))；美国专利4,742,158公开了一种生产含preS肽的疫苗的方法，其中通过在细胞破碎步骤中使用一种蛋白酶抑制剂保护所述的肽不受蛋白酶攻击。然而，Kobayashi等的遗传修饰方法对preS2肽的活性的影响没有充分阐明，而后一方法是不实用的，因为蛋白酶抑制剂太昂贵而不能用在大量纯化过程中。另外，当由于纯化规模或纯化要求加大而使得纯化时间变长时，不管蛋白酶抑制剂的用量多大都不能使preS2肽的水平保持在一定量。

欧洲专利0337492A1提供了一种用硫氰酸钾从毕赤酵母培养物中提纯HBsAg的方法。硫氰酸钾用于提高亲脂蛋白的产量，整个方法的目的是纯化仅含S肽的HBsAg。当HBsAg还包含位于由226个氨基酸组成的S肽之前的由55个氨基酸组成的preS2肽时，它的免疫性质与仅含S肽的表面抗原的免疫性质相似，因为S肽组分的抗原性和免疫原性是相同的。但是这两种表面抗原的物理化学特性都是不同的。特别是preS2肽有足够的亲水性而可暴露在抗原颗粒的表面，因此，它对纯化步骤有重要的影响。

因此，已开发出各种纯化含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法。