[发明专利]形成粘蛋白糖链的肽序列和修饰蛋白质使与粘蛋白糖链相连的方法

说明书

                   发明背景

                   发明领域

本发明涉及可将粘蛋白型糖链导入蛋白质或肽的氨基酸序列，还涉及利用该序列将粘蛋白型糖链导入蛋白质或肽的技术。

                   背景技术

在动物，植物和昆虫等生物中发现的许多蛋白质是糖蛋白。最近几年已揭示了糖蛋白链的各种作用。例如，已知糖链在细胞粘着和细胞识别中具有作为配体的生理作用以及具有增强蛋白质的稳定性和/可溶性的物理化学作用。另外，尽管诸如促红细胞生成素和干扰素的糖蛋白最近几年已制成药品，人们已认识到糖蛋白上糖链的结构对药品在体内的药物动力学和稳定性有极大的影向。尽管已充分认识到糖蛋白的糖链的意义，但目前对于以简单的方式将糖链导入蛋白质的特定位置尚未形成确定的技术。

对于一些原来是糖蛋白的药品，典型地用大肠杆菌成批生产仅是它们的蛋白质部分。当这种蛋白质作为药品施用时，由于缺少糖链该蛋白质的体内动力学，稳定性和抗原性有时与天然糖蛋白不同。从而这些差异可能产生包括大剂量损害和副作用的问题。

即使用动物的培养细胞生产的蛋白质，虽然可以产生具有糖链的糖蛋白，但它也可能不同于天然糖蛋白。因此，这些蛋白质也可能遗留有上述问题。

使用将糖链导入蛋白质分子特定位置的技术可解决上述问题及其它有关问题。而且，用这一技术可将糖链的各种功能特征导入蛋白质。此外，该技术在制药工业和其它工业上显示出广泛的各种用途。

已知糖链结合蛋白质的两种主要模式：天冬酰胺结合型糖链和粘蛋白型糖链。

根据此前的各种报道，天冬酰胺结合型糖链在与糖链的结合位点上显示有共有序列-Asn-Xaa-Ser-/Thr-(Xaa≠Pro)。然而，也了解到在蛋白质上并非所有具有共有序列的位点都有一个天冬酰胺结合型糖链。另一方面，对于粘蛋白型糖链，有报道指出靠近结合位点经常观察到诸如Ser，Thr和Pro的氨基酸。然而尚无报道描述过结合位点序列的完全特征。

天冬酰胺结合型糖链在糖链形成上不同于粘蛋白型糖链。具体地说，天冬酰胺结合型糖链与蛋白质的翻译同时发生，然后接着进行糖蛋白的折叠。而粘蛋白型糖链则在糖蛋白的翻译和折叠后导入。另外，对于天冬酰胺结合型糖链，已报道具有14个单糖的大型糖链一次性地结合到蛋白质分子上，此糖链被称为carnexine的分子伴侣识别并调控而形成正确的蛋白质结构。然而到现在为止对于粘蛋白型糖链这样的分子伴侣还未发现。

因此，如前所述，虽然天冬酰胺结合型糖链的糖链结合部位已经明确，但找到导入糖链的确切位点却并非容易。另外，即使将糖链导入蛋白质后，也不能保证该蛋白质显示出与模式蛋白相同的构象和活性。

另一方面，粘蛋白类型糖链，对于蛋白质分子结构的影响很小，因为糖链是在蛋白质分子折叠后导入的。因此，将粘蛋白型糖链导入蛋白质的技术对于提供具有功能特征的糖链的蛋白质而保持该蛋白质的结构和活性不变是非常有前途的。然而，尚未发现对粘蛋白类型糖链结合位点具有高度特异性的结构特征。因此，到目前为止，将糖链特异性地导入蛋白质分子的某一部位是不可能的。

正如下文所要描述的，了解了肽序列结合糖链的一些特征方面，同时还了解了用于将GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)作为粘蛋白型糖链导入蛋白质中的一种酶。该酶称为UDP-GalNAc：多肽α1，O-GalNAc转移酶(O-GalNAc T)。另外，在奶牛初乳中发现了O-GalNAc T，它催化如下的反应，其中GalNAc被转移到蛋白质或肽的丝氨酸或苏氨酸残基上：

UDP-GalNAc+蛋白质→蛋白质-GalNAc+UDP其中UDP代表尿核苷5′-二磷酸，GalNAc代表N-乙酰半乳糖胺。