[发明专利]在转基因动物中生产纤维蛋白原

说明书

发明背景

血液凝集系列反应的最后一步是由凝血酶催化将可溶性的血浆蛋白纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白。凝血酶从纤维蛋白原的三条组成链之一(Aα)上切下一条小肽(纤维蛋白肽A)。随后纤维蛋白发生聚合，并在凝血因子XIII的激活下交联形成稳定的血栓。

纤维蛋白原是生物组织胶的一个关键成分(见U.S.Patent Nos.4,377,572和4,442,655)，生物组织胶能模拟自然血栓的形成，启动止血过程及修复受损组织。组织胶提供缝合线，卡钉以及其它缝合伤口的机械方法的附件或替代品。然而，这些产品的基本组分(纤维蛋白原，因子XIII和凝血酶)是从人的血浆库中通过低温沉淀(例如U.S.Patent Nos.4,377,572；4,362,567；4,909,251)或乙醇沉淀(例如U.S.PatentNos.4,442,655)或者是从单一提供者血浆中(如U.S.Patent No.4,627,879，Spotnitzet al.，Am.Surg.55：166-168，1989)制备的。得到的纤维蛋白原/因子XIII制剂在使用前迅速与牛凝血酶混合，将纤维蛋白原转变成纤维蛋白，并激活因子XIII，由此开始粘合剂的凝聚过程。

市场上可得到的粘合剂来源于血库中的血浆，由于血源产品已伴随有人免疫缺陷病毒(HIV)，肝炎病毒和其它致病原的传播，因此限制了这类粘合剂的可接受性和可得性，现在它们在美国已禁止使用。

使用自体血浆可降低疾病传播的危险，但自体粘合剂仅能使用于有选择的外科手术中，而且患者要预先提供所需的血液。

如上所述，纤维蛋白原由三种多肽链组成，每一种在装配好的分子中以双体存在。这些被命名为Aα，Bβ和γ链的多肽链，在肝脏中协调表达，装配和分泌。尽管可预期重组DNA技术已能提供一种替代方法来代替从血浆中分离纤维蛋白原，这一点已证明是有困难的。三种纤维蛋白原多肽链已分别单独在E.coli中表达(Lord，DNA 4：33-38，1985；Bolyard and Lord，Gene 66：183-192，1988；Bolyard and Lord，Blood 73：1202-1206)，但有功能的纤维蛋白原还没能在真核系统中生产出来。生物感受态纤维蛋白原在酵母中的表达还未见报道。培养的转染的哺乳动物细胞已被用来表达生物感受态纤维蛋白原(Farrell et al.，Blood 74：55a，1989；Hartwig and Danishefsky，J.Biol。Chem.266：6578-6585，1991；Farrell et al.，Biochemistry 30：9414-9420，1991)，但表达水平之低使得生产商业数量的重组纤维蛋白原不具可行性。实验证据说明，与肝脏相比，培养细胞中的较低的转录效率可能是表达水平低的一个原因，但在转染的BHK细胞中增加纤维蛋白原链的mRNA的总量并没有引起纤维蛋白原蛋白分泌的相应增加(Prunkard and Forster，XIV Congress of the International Society on Thrombosisand Haemostasis，1993)。后面的这些结果暗示，纤维蛋白原的正确装配与加工有一些组织特异性的机制，而这些机制在普通的实验条件下的细胞株中并不存在。

现有技术中还需要生产大量的高质量的用于组织粘合剂和其它用途的纤维蛋白原的方法，更需要的是不含血液病原体的纤维蛋白原。本发明满足了这些需要并提供了其它有关的优势。

发明概述

本发明的一个目的是提供商用数量的重组纤维蛋白原，尤其是重组人纤维蛋白原。本发明的另一个目的是提供在转基因动物，特别是家畜，如牛，绵羊，猪和山羊的乳腺组织中表达纤维蛋白原的材料和方法。