[发明专利]蜘蛛神经毒素及其生产方法

说明书

本发明涉及一种新的毒素以及生产毒素的方法，尤其不仅仅限于一种昆虫特异性神经毒素δ-毒蛛昆虫毒素(Latroinsectotoxin)(δ-LIT)以及它们的生产方法。

在毒寇蛛(Latrodectus mactans Tredecimguttatus)的毒液中已发现一个高分子量的神经毒素家族。这些毒素中一些已被鉴定为具有脊椎动物或无脊椎动物特异性。α-毒蛛毒素(α-LT)和α-毒蛛昆虫毒素(LIT)为已被分别表明为具有脊椎动物和无脊椎动物特异性的两种神经毒素。这些蛋白质的一级结构已被确定，但由于不能实现它们基因的功能表达，因此不可能表征被克隆毒素的结构特征。

本发明的目的是提供一种新的毒素及利用重组技术生产一种通常由前体蛋白的翻译后修饰自然产生的毒素的方法。

根据本发明提供了一种由基因序列的截短形式表达产生截短多肽如毒素或它的类似物。

多肽优选多神经毒素，优选对应于由基因序列编码的基本上无毒的前体多肽的毒性衍生物。多肽可包含对应于基本上无毒的前体多肽的氨基酸序列的截短形式。多肽的氨基酸序列优选对应于主要在羧基(C)端被截短，且合意的截短发生在约150至200个氨基酸的前体多肽的氨基酸序列。此外，多肽的氨基酸序列还可对应于在氨基(N)端被截短优选少于50个氨基酸，且合意的为7或28个氨基酸的前体多肽氨基酸序列。

多肽的氨基酸序列可能与昆虫特异性神经毒素δ-毒蛛昆虫毒素(δ-LIT)或它的活性衍生物的氨基酸序列同源，优选包括如序列1和序列2所示的氨基酸序列或它的活性衍生物。毒素优选由包括序列1所示序列的基因序列的核苷酸结构物或其截短形式或它的活性变异体表达。毒素优选由基本上如保藏在The  National  Collecticns  of Industrialand  Marine  Bacterinl  ILimited，保藏号为NCIMB 40632中的微生物所提供的序列表达。    

本发明还提供了一种用作毒素的蛋白质，包括基本上如序列1和序列2所示的氨基酸序列或其活性衍生物。

根据本发明的另一方面，提供了一种核苷酸序列，包括基因序列的截短形式或其类似物，用于多肽如毒素的表达。

核苷酸序列优选对应于编码前体多肽并在3’端被截短的基因或其活性衍生物。核苷酸序列优选对应于被截短400至650个核苷酸碱基，且合意的为550至600个之间的核苷酸碱基的基因。

核苷酸序列也可对应于在其5’端被截短的基因，优选截短少于100个核苷酸碱基，且合意的为84或21个核苷酸碱基。

核苷酸序列优选对应于部分编码毒寇蛛的毒液中的神经毒素或其活性衍生物的基因。

核苷酸序列可对应于部分编码昆虫特异性毒素δ-毒蛛昆虫毒素(δ-LIT)的前体多肽或其活性衍生物的基因。核苷酸序列优选编码包含991个氨基酸序列的多肽。

核苷酸序列优选包含序列1所示的碱基序列或其活性衍生物，优选如保藏在The  National  Collecticns  of  Industrial  and  MarineBacterinl  Limited，保藏号为NCIMB 40632的微生物所包含的碱基序列。

核苷酸序列优选编码具有如序列1和序列2所示的氨基酸序列的多肽或其活性衍生物。

核苷酸序列可为使用酶如逆转录酶从mRNA衍生而来的cDNA。用另一种方法，核苷酸序列可为使用聚合酶链反应(PCR)产生的寡核苷酸DNA结构物。

根据本发明的另一个方面，提供了一种生产多肽的方法，该方法包括制备包含基因截短形式的重组DMA分子，并在宿主表达系统，如病毒或细菌表达系统中表达截短形式生产多肽。

生产的多肽优选为活性毒素，且合意的为基本上如上所定义的神经毒素。截短形式优选包含编码非毒性的前体多肽的基因的部分。

截短形式优选包含基本上如上所定义和如序列1所示的核苷酸序列或其活性衍生物。表达系统包含用包含该序列截短形式的载体pT7-7转化的E.coli  BL21(DE3)细菌细胞，且合意的为基本上如保藏在The  National  Collecticns  of  Industrial  and  Marine  BacterinaLimited，保藏号为NCIMB 40632。表达系统可包含杆状病毒系统。