[发明专利]神经胶质细胞促有丝分裂因子，其制备和应用

说明书

相关申请的参考

本申请为如下申请的部分继续申请：系列号No.08/036,555，申请日1993-3-24，系列号No.07/965,173，申请日1992-10-23，系列号No.07/940,389，申请日1992-9-3，系列号No.07/907,138，申请日1992-6-30，系列号No.07/863,703，申请日1992-4-3。

本发明的背景

本发明涉及存在于脊椎动物中的若干多肽，这些多肽为神经胶质细胞包括施旺细胞的促有丝分裂生长因子。本发明还涉及能够制备这些因子的方法，以及这些因子在治疗上的应用。

脊椎动物神经胶质细胞构成了中央和周围神经系统的特异的连接组织。重要的神经胶质细胞包括施旺细胞，它为神经元提供代谢支援，并为某些周围神经元的轴突提供髓磷脂鞘，因而形成各神经纤维。施旺细胞在邻近的神经元的轴突周围形成同轴的膜层，并围绕轴突生长、扭转，支持神经元，并提供鞘的作用。这些髓磷脂为许多神经纤维的易感因子，而且，施旺细胞的损伤或生长发育的失常，可导致许多周围神经系统疾病和失调，如严重的脱髓鞘或神经退化等病征。在神经系统的发育中，很显然，细胞需有各种因子调节其分化与生长，而近年来各种此类因子已经得到了鉴定，其中包括已发现的一些对于施旺细胞分化或发育起作用的因子。

Brockes等，(另有其它文献)，于“神经科学杂志”(J.Neuroscience，4，(1984)75-83)上描述了一种从牛脑和脑垂体组织的抽提物中得到的蛋白质生长因子，命名为神经胶质生长因子(Glial Growth Factor，GGF)，该因子刺激在含10％牛胎血清培养基中培养的鼠的施旺细胞分化。该因子据描述分子量为31,000道尔顿并易形成二聚体。在“酶学方法”(Meth.Enz.，147(1987)，217-225)中描述了一种以施旺细胞进行的GGF试验。

Brockes等，(文献同上)，还描述了一种使GGF明显均质的纯化方法。简要地，其描述的一种大量纯化的方法包括从冷冻牛前叶中抽提，得到的样品材料进行层析，从CM-纤维素上用NaCl梯度洗脱。然后用Ultrogel柱进行凝胶过滤，接着用磷酸-纤维素柱洗脱，最后是小量SDS-凝胶电泳。方法也可变动，以CM-纤维素材料直接应用于磷酸纤维素柱，收集过柱组分并以天然制备凝胶电泳纯化，随后进行最后的SDS凝胶电泳。

Brockes等发现以前的报道的凝胶过滤实验中(Brockes等(“生物化学杂志”J.Biol.chem.225(1980)8374-8377)，生长因子的活性主峰迁移至分子量56,000道尔顿，而在上述的前一种流程中，更具活性的部分为分子量31,000道尔顿。据称，在此流程中经过CM-纤维素梯度洗脱后，使得GGF二聚体被大大地去除了。

Benveniste等(PNAS，82(1985)，3930-3934)描述了一种T淋巴细胞衍生的神经胶质生长促进因子。这种因子在还原条件下，SDS-凝胶上呈现出明显的分子量变化。

Kimura等(“自然”，Nature，348(1990)，257-260)描述了从一坐骨神经鞘肿瘤中得到的一种因子，称之为神经鞘瘤衍生生长因子(Schwannoma-derived growth factor，SDGF)。作者称SDGF并不刺激氚标记的TdR进入施旺细胞，而与之相反，在同样条件下，含有GGF的部分纯化的脑垂体组分却有此活性。SDGF的表观分子量处于31000D至35000D之间。

Davis和Stroobant(细胞生物学杂志，J.Cell.Biol.，110(1990)1353-1360)描述了对若干候选促有丝分裂剂的筛查。实验使用大鼠施旺细胞，培养基含有10％FCS(牛胎血清)，在加入或不加入forskolin的条件下，测试各待测样品对施旺细胞中DNA合成的刺激能力。这些被测试的因子之一为GGF-羧甲基纤维素组分(GGF-CM)，当FCS存在，不论有否forskolin，它都具有促细有丝分裂作用。这项工作揭示，在forskolin存在下(主要条件，也需其它)，血小板衍生的生长因子(PDGF)对施旺细胞是一有效的促有丝分裂剂。PDGF从前曾被以为对施旺细胞没有作用。

Holmes等(“科学”，Science(1992)256：1205)和Wen(“细胞”，Cell(1992)69：559)称，编码与受体(p185^erbB2)结合的蛋白质DNA序列，与多种人类肿瘤相关。