[发明专利]生产核酸的拷贝

说明书

本发明涉及一种产生至少是部分核酸链的拷贝的方法。

在遗传工程领域，经常有这样的情况：样品中仅存在非常少量的核酸，而以研究或诊断测试为目的，则需要大量的全序列或部分序列核酸。也就是说，可能需要知道某种特定的核酸是否存在于样品中(比如：确定一个人是否被一种特定的病毒感染，可以是DNA，也可以是RNA，或者确定在他们的核酸中存在或不存在有特定的序列)。如果存在于样品中的话，由于核酸的量是低于可检测限度的，所以需要对样品做扩增反应，这样即可产生更多量的核酸(如果存在的话)。然后，可通过检测来确定核酸的存在与否。如果检测结果为阳性的，则证明核酸存在于原始样品中。相反地，若结果为阴性的，那么可以证明核酸不存在于原始样品中。

本发明涉及不同的技术，用这些技术，可以使存在于或潜在存在于样品中的核酸得到扩增，产生大量核酸。

根据本发明的第一个方面，提供了一种方法，用该方法可以产生至少是部分核酸链(“靶链”)的拷贝，靶链是存在于或潜在存在于样品中的，本方法包含下列步骤：(i)提供了一种固相支持系统，其上固着有大量的单链寡核苷酸，这些平链寡核苷酸能同靶链杂交。(ii)(a)清洗支持系统以除去未杂交物质。(iii)产生靶1链的拷贝，该链掺入了固相的寡核苷酸及包含同至少是部分靶链互补的核苷酸序列，也就是说生成的靶1链拷贝中至少有一部分是以靶链为模板而生成的，并且，如果需要，可以是靶1序列拷贝的全部。(iv)使同靶1链拷贝相杂交的靶链变性，然后可选择使至少是部分的靶链同支持系统上的尚未转变为靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交。(v)同时，(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝作为模板来生成(从杂交干靶1链上的引物来生成)靶2链拷贝，该链包括了感兴趣的核酸序列，并且(b)用靶链为模板，如果他们已经同固定的寡核苷酸杂交了的话，再次产生至少是部分的靶1链拷贝，并且(如果需要)，可完成靶1链的形成，并且(vi)按所需要的次数重复步骤(iv)和(v)，在每次重复步骤(iv)和(v)时，用靶2链拷贝来进一步生成靶1链拷贝。

如前所述，本发明的方法对于含有或不含感兴趣的核酸的样品均有效。如果核酸不存在，那么上面列出的步骤(iii)-(vi)将不会导致靶1链拷贝和靶2链拷贝的产生。此外，不能生成靶2链拷贝提供了有价值的信息，因为在实行的检测步骤中，将确定靶2链拷贝的存在，若结果为阴性，则证明靶链不存在于原样品中。

清洗步骤(ii)(a)使得未杂交物质从支持系统上被移去，这样使得用于步骤(iii)中的靶链样品将是无污染的。因而，在原样品中存在的污染物将不会参与本发明方法的其后的反应。

在步骤(iv)中，靶链可同支持物上的未延伸寡核苷酸再杂交。或者在步骤(v)之前，可将原始的靶链从固相支持系统上移去。

按以下所述操作也是可取的：在整个的从步骤(iii)-(vi)的顺序操作中，在每次杂交反应后和/或在每次链合成反应后和/或连接反应后，洗涤固相支持系统和/或移去反应试剂。这样，比如，在步骤v(b)中引入的过量的引物就可在(至少是部分的另外的)靶1链拷贝产生前被去除。

寡核苷酸优选地共价同固相支持物相联。优选地，固相支持系统是是一种颗粒组成的系统并且寡核苷酸是固定于颗粒之上的。颗粒组成的支持系统的应用是其自声权利的一个重要特征。并且因此根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种方法，用该方法可以产生至少是部分的核酸链(靶链)的拷贝，其中靶链是存在于或潜在存在于样品中，本方法包括以下步骤：(i)提供了一种颗粒组成的固相支持系统，其上固定有大量的单链寡核苷酸，这些寡核苷酸可同靶链杂交。(ii)提供了单链形式的靶链并且可使靶链同支持物上的寡核苷酸链杂交，寡核苷酸链的数目要远远大于靶链的数量。(iii)产生靶1链拷贝，其掺入了固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶链互补的核酸序列，也就是说生成的靶1链拷贝至少有一部分是以靶链为模板而生成的，并且，如果需要，可以完成靶1序列拷贝的形成。(iv)变性同靶1链拷贝相杂交的链并且可任选将至少是部分的先前的靶链同支持物上的尚未转化为靶1链拷贝的寡核苷酸再杂交。(v)同时，(a)用固定于固相支持物上的靶1链拷贝作为模板来生成靶2链(从同靶1链拷贝杂交的引物上生成)，该链包括感兴趣的核酸序列，并且，(b)用靶链作为模板，如果靶链已同固定的寡核苷酸杂交，来进一步生成至少是部分的靶1链拷贝，并且(如果需要)可完成靶1链拷贝，而且(vi)按所需次数重复步骤(iv)和(v)，在步骤(iv)和(v)的每次重复中，用靶2链拷贝来进一步生成靶1链拷贝。