[发明专利]寡核苷酸的环糊精细胞输送系统

说明书

发明背景

本发明涉及反义疗法。更为具体地说，本发明涉及促进反义寡核苷酸的细胞吸收的组合物及方法。

已经研制了那些能够调节细胞及外源基因表达的新的化学治疗试剂。这些试剂，被称为反义寡核苷酸，它们是能够根据Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对法则结合靶核酸分子的单链寡核苷酸，并且以这种方式，通过以下数种机制之一摧毁靶的功能：阻止与正常转录，拼接或翻译所需要的因子的结合；引发RNaseH对RNA的酶解性破坏，或者是通过反应基团与反义寡核苷酸的直接结合而破坏靶。因此，它们已成为特异性抑制基因表达序列的广泛使用的研究工具，并已在进行作为治疗性试剂的可行性审查。(见Agrawalet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：3860-3884；Bayever et al.，1992，Antisense Res.Development 2：109-110)。

为了使反义分子具有治疗价值，必须使其有能力进入细胞内并且接触到靶子的内源性核酸。另外，它们必须能够抵抗细胞内的高度核酸裂解性环境的严峻挑战。

最近的研究已经表明，具有某些修饰，例如人工的核苷酸间的连接的寡核苷酸分子，不仅表现出对核内降解作用的抗性(见Agrawal et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：7079-7083；Agrawal et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：7790-7794；Gao et al.1990，Antimicrob.Agents Chem.34：808；Storey et al.，1991，Nucleic Acids Res.19：4109)，而且能够增强细胞对其的吸收。例如，具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯类的核苷酸间连接(linkage)的寡核苷酸，已被发现能比具有磷酸二酯连接的寡核苷酸更容易结合上，并被吸收到细胞内。(Zhao et al.，1993，Antisense Res.Dev.3：53-56)。

寡核苷酸的吸收是可饱和的，序列非依赖性的，以及温度与能量依赖性的。虽然有些证据表明此种吸收可能是通过一种分子量为80,000 dalton的膜蛋白发生的(Loke etal.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3474；Yakubov et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86：6454)，但这种蛋白的基因还未被克隆或鉴定。有项研究说，寡核苷酸的吸收是通过孔穴式的胞饮机制而非内吞机制(Zamecnick，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3156)。寡核苷酸的吸收究竟是通过受体介导的内吞途径，还是胞饮机制，或是它们的联合作用，目前仍所知甚少。

为了改善细胞对寡核苷酸的吸收，用不同于上述方法的多种途径对寡核苷酸进行了修饰。例如，WO9323570揭示了一种具有改善了的细胞吸收作用的寡核苷酸，在其中至少有一个核苷酸残基在其2’位置共价连接有不同的分子，包括氨基酸，多肽，蛋白质，糖类，磷酸糖类，神经递质，激素，环糊精，淀粉，固醇，或维生素。在抗生物素蛋白存在时生物素化的寡核苷酸的细胞吸收的增强也得到证实(Partridge et al.，1991，FEBSLett.288：30-32)。

另外，磷酸二酯键连接的寡聚脱氧核苷酸已通过成孔试剂streptolysin 0导入细胞内(Barry et al.，1993，Biotechniques 15：1016-1018)，而且一种包括阳离子脂类的脂质体制剂也显示出能增强靶子为人类细胞间黏附分子的一部分的反义分子的细胞吸收(Bennett et al.，1992，Mol.Pharmacol.41：1023-1033)。携带5’胆甾醇化修饰的磷酸二酯键连接的寡核苷酸显示了细胞吸收及生物效应的加强(Krieg et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1048)。抗体导向的脂质体也已被用来增强靶子为HIV感染的细胞所表达的HLA-I分子的寡核苷酸的细胞吸收(Zelphati et al.(1993)Antisense Res.Dev.3：323-338)。