[发明专利]用DEAE-5PW阴离子-离子交换色谱和疏水作用色谱纯化硫代磷酸寡脱氧核苷酸

说明书

                  发明背景

发明领域

本发明涉及寡脱氧核苷酸纯化领域，特别是硫代磷酸寡脱氧核苷酸的纯化。

现有技术描述

过去几年来，在为治疗目的的选择性基因调节领域中，使用修饰的磷酸酯骨架寡脱氧核苷酸作为反义寡核苷酸已得到越来越多的关注。现已将几种类型修饰的磷酸酯键，例如，膦酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、掺入到反义寡核苷酸中并对此进行了研究。例如Erickson和Izant(Eds.)“基因调节(Gene Regulation)：反义RNA和DNA生物学”(Raven出版社，纽约，1992)。已发现硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸能抑制免疫缺陷病毒[Agrawal等“全美科学通报”(Proc.Natl.Aca d.Sci.USA)85，7079(1988)；Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，7790(1989)；Agrawal等，“改进的药物释放综述”(AdvancedDrug Delivery Reviews)6，251(R，Juliano，Ed.，Elsevier，Amsterdam，1991)；Agrawal等，“癌症和艾滋病反义核酸治疗展望”(Prospects for AntisenseNucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS)，143(E.Wickstrom，Ed.，Wiley/Liss，New York，1991)；和Zamecnikl和Agrawal“艾滋病研究年度回顾”(Annual Review of AIDS Research)，301(Koff等，Eds.，Dekker，NewYork，1991)]，并能抑制组织培养中的流感病毒(Leiter等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 87，3420-3434(1990))。另外，各种基础研究均集中在硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸(例如，Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1401(1990)和Eckstein和Gish，Trends Biochem.Sci.14，97(1989))；酶抑制研究(Mujumdar等，“生物化学”28，1340(1989))；癌基因表达的调节(Reed等，“癌症评述”50，6565(1990))和IL-1表达(Manson等，Lymphokine Res.9，35(1990))上。

自动合成仪已经是获得寡核苷酸的一种非常有价值的工具。寡核苷酸是分步合成的，每隔一定时间向新生成的寡核苷酸链上加上一种单体。在每一反应周期中尽管加入核苷酸单体，但还有2-3％的反应不能进行。因此所得产物一般是不同长度寡核苷酸的不均匀混合物。例如，在典型的链长为20个单元的产物合成中，该20个单元产物只代表50～60％回收率的寡核苷酸产物。

而且，在固相载体上制备寡脱氧核苷酸需要将寡脱氧核苷酸从载体上解脱下来。将该寡聚物从载体上解脱下来一般是用浓氢氧化铵处理该固相。常规下再用例如旋转蒸发器在减压下去除该氢氧化铵。但是这种去除氢氧化铵的方法不宜用于大规模分离寡脱氧核苷酸。

对于很多目的(例如治疗或诊断)来说，化合物的纯度是极其重要的。因此有兴趣开发纯化寡核苷酸的色谱技术。因为就其治疗上应用的药效而言，关键多数在于如何纯化硫代磷酸寡核苷酸的问题。

纯化寡脱氧核苷酸的常规方法是使用反相液相色谱。这种方法需要有防爆装置，因为一般在洗脱缓冲液中使用了乙腈。

硫代磷酸寡脱氧核苷酸纯化的方法已有报导。Agrawal等“色谱杂志”(J.Chromatography)509，396(1990)报导了使用反相柱高效液相色谱分离硫代磷酸寡核苷酸。在该项研究中，Agrawal等将硫代磷酸寡核苷酸转化成其磷酸二酯对应物，然后进行HPLC分析。使用该方法能在强阴离子交换柱(Partisphere SAX柱)上分析含有10个或更少核苷酸的硫代磷酸寡核苷酸。但是因为与SAX基质发生强的相互作用，不能分析比10个核苷酸多的硫代磷酸寡核苷酸。