[发明专利]虫荧光素酶标记方法和标记的产物

说明书

本发明涉及一种标记化学物质，特别是生物物质的方法，该标记的目的是为了化学，和特别是生物测试，以及更具体地说是特定的结合测试，例如免疫测试以及杂交探针技术和在特定的扩增产物中将标记掺入，如在测试中应用PCR形式时。

虫荧光素酶介导的虫荧光素的断裂(Eqn 1)有高的产率和稳定的光输出，使之可以应用相对简单的设备检测很低浓度的酶(参见McCapra，在Turner等(编辑)生物传感器：基础和应用，Oxford University Press，(1988)：617-37中生物发光和化学发光的潜在应用)。已发展了许多应用虫荧光素酶作为间接标记的方法(参见Wanilund和DeLuca，在Deluca和McElroy(编辑)生物发光免疫测试：用于测定甲氧盐和DNP的虫荧光素酶抗原凝集，生物发光和化学发光：基础化学和分析应用。伦敦：Academic Press(1981)：693-696新的酶免疫分析的超敏感检测系统，临床化学和临床生物化学杂志(Clin.Chem.Clin.Biochem.J)(1987)25，31-28和Murakami等，在Szalay等(编辑)生物发光和化学发光：现状报告，Chichester：John Wiley and Sons，(1993)296-300中‘应用腺苷酸激酶和荧火虫虫荧光素酶的生物发光检测系统的发展’。

本发明人注意到应用虫荧光素酶作为直接标记在保持敏感性的同时可大大简化测试设计，但就需要可将其与测试结合试剂偶联而又不导致已知为非常不稳定的酶促活性灭活的方法。常规的共价偶联试剂如戊二醛，SMCC和SMPB快速且不可逆的抑制虫荧光素酶的活性。

虫荧光素酶，例如来自Photinus Pyralis的，含有7,725-737四个半胱氨酸残基(参见Wet等(1987)分子和细胞生物学)，其中两个残基靠近活性位点或者是活性位点的一部分(参见Deluca和McElroy(1978)酶学方法，57，3-15)。本发明人确定共价偶联试剂与这些残基的结合引起了所看到的对酶的灭活并提供了一种可保护酶不被非可逆的灭活的将虫荧光素酶与测试试剂偶联的方法。

因此本发明的第一个方面即提供了一种将虫荧光素酶与化学本体，特别是一种特异的结合试剂例如抗体，抗原或核酸，更特别是一种抗体结合的方法，它包括(a)将虫荧光酶与一种或多种D-虫荧光素，镁离子和腺苷三磷酸混合和(b)用共价偶联试剂进行虫荧光素酶和结合试剂之间的共价偶联反应，其中D-虫荧光素，镁离子和/或腺苷三磷酸的量足以保护虫荧光素酶的活性免受共价偶联试剂的抑制。优选步骤(a)操作是将虫荧光素酶与其溶液形式的底物混合并且优选镁和腺苷三磷酸二者以腺苷三磷酸镁(Mg²⁺ATP)的形式存在，可选择地与D-虫荧光素在一起。优选只存在Mg²⁺ATP或D-虫荧光素之一。如果Mg²⁺ATP和虫荧光素三者都存在，那么优选要在反应混合物中除去氧。

在本发明的第二个方面提供了一种标记的化学本体，它包含通过本发明的方法所提供的与活性虫荧光素酶结合了的化学本体。优选化学本体是一种适于用于特定的结合测试的特异的结合试剂，优选是一种抗体，抗原或核酸。当结合试剂是核酸时优选寡核苷酸，但可以是多核苷酸或单个核苷酸，并且可被用做杂交探针或链延伸引物，例如PCR引物。最好本体是一种以前试图将抗体与虫荧光素酶偶联而结果却是几乎全部失活的抗体。

提供虫荧光素酶标记的化学本体，和特别是虫荧光素酶标记的抗体的一个具体地优点是使光导向装置相关的捕获测试成为可能。在一个优选的这类测试中，靶抗原的捕获抗体被固定到一个光导向装置上，例如一个可将照在其上的光线输入到光测量装置如光电倍增管上的光导纤维；被测抗原以液体样品形式用于光导向装置并且第二种以虫荧光素酶标记为特征的抗体在溶液中与光导向装置接触，在那里它与已被捕获并已与捕获抗体结合的抗原结合。

为了确定捕获的抗原的存在和/或其量，只需要将溶液中的D-虫荧光素和Mg²⁺ATP与结合有抗原-抗体复合物的光导向装置的表面相接触，并测量发射并转移到光测量装置如光电倍增管中的光的量即可。用这种方式即可进行有更高敏感性的光度(luminometric)测试，通过应用几种能分别捕获不同的抗原的光导向装置并将其放在一个样品室中以使可在同一步中加入几种不同的虫荧光素酶标记的抗体而同时进行几种不同的免疫测试而提供多种特异性。