[发明专利]有效地作为无毒口服佐剂的突变肠毒素

说明书

在本说明书中所述的研究由美国海军部分资助，授与号N00014-83-K-0192。政府对本发明享有一定权利。

1.发明领域

本发明涉及大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)的一种遗传学上独特突变型，及其作为一种口服佐剂用于诱导粘膜和血清抗体。特别地，该突变LT被一个氨基酸取代而修饰，使其失去固有的毒性，但保留了该分子完整的佐剂特点。

2.发明背景

微生物病原体可以通过几种机制中的一种感染宿主。它们可以通过外伤引起的外皮破裂进入，可以被载体传导而导入或与粘膜表面相互作用。大多数人病原体通过最后一种机制，即与粘膜表面相互作用后始发疾病。通过这种机制作用的细菌和病毒病原体首先与粘膜表面接触，它们可以在那儿附着，然后定居或被特化的表皮中遮盖派伊尔结及其它淋巴滤泡的吸收细胞(M细胞)摄取〔Bockman及Cooper，1973，Am.J.Anat.136：455-477；Owen et al.，1986，J.Infect.Dis.153：1108-1118〕。进入淋巴组织的生物体可在淋巴滤泡里被容易地杀死，因此作为提供给滤泡中免疫细胞的抗原(如霍乱弧菌)激起可能的保护免疫应答。或者经过局部防御机制仍能存活的病原生物体可能从滤泡传播并继而引起局部的或系统疾病(即免疫受损害宿主中的沙门菌属细菌，脊髓灰质炎病毒，轮状病毒)。

针对感染生物体的特异毒力决定簇的分泌IgA(sIgA)抗体在总体粘膜免疫方面起重要作用〔Cebra et al.，1986，In：Vaceines 86，Brown et al.，(ed.)Cold Spring Harbor Laboratorg，New York.p.p 129-133〕，在许多情况下，通过刺激产生针对感染生物体的相应毒力决定簇的粘膜sIgA水平，来预防粘膜表面的初始感染是可能的，分泌IgA可以通过封闭附着和/或定居，中和表面作用毒素或防止宿主细胞的侵袭来防止病原体与粘膜表面的初始相互作用。虽然已经做了广泛的研究来确定，细胞介导的免疫及血清抗体在抵抗感染因子的保护作用方面的作用，对sIgA的调节，诱导和分泌却知之甚少。非肠道施用灭活的完整细胞和完整病毒的制剂对引发保护性血清IgG和抵抗在发病机理中具有明显血清期的生物体(即伤寒杆菌，B肝炎)的延迟型超敏反应是有效的。然而，非肠道疫苗对引发粘膜sIgA反应无效，并对与粘膜表面相互作用但不侵入的细菌(如霍乱弧菌)无效。但最近有这样的证据，即非肠道施用的疫苗可能至少对一种病毒有效，它是首先与粘膜表面相互作用的轮状病毒〔Conner et al.，1993，J.Virol.67：6633-6641〕。推测保护作用来自抗原特异性IgG渗出到粘膜表面来中和病毒。因此，同时刺激血清和粘膜抗体的机制对有效疫苗是重要的。

如果抗原提呈到优先起始IgA B-细胞形成的派伊尔结中的T、B淋巴细胞和辅助细胞，则口服免疫对诱导特异sIgA反应有效。派伊尔结含有介导B-细胞直接从IgM细胞同型转换到IgA B-细胞的辅助T(TH)-细胞。该结还含有启动终未B-细胞分化的T-细胞。已接触抗原的B-细胞然后迁移到肠系膜的淋巴结并进行分化，进行胸导管，然后进入总循环，并播种到机体所有的分泌组织，包括肠固有层和呼吸道。然后由成熟的浆细胞产生IgA，IgA与结合在膜上的分泌成分复合，转运到能与侵入病原体相互作用的粘膜表面上〔Strober andJacobs，1985，In：宿主防御机制的进展，第4卷，粘膜免疫Gallin andFauci(ed.)，Raven Press，New York.p.p.1-30；Tomasi and Plaut，1985，In：宿主防御机制的进展，第4卷，粘膜免疫Gallin and Fauci(ed.)，Raven Press，New York.p.p.31-61〕。这种共同的粘膜免疫系统的存在部分解释了对抵御通过首先与粘膜表面相互作用而始发感染的病原生物体起保护作用的活口服疫苗和口服免疫的可能性。