[发明专利]用具有提高的连接酶活性的微生物产生β-内酰胺类抗生素的方法

权利要求书

1.一种产生β-内酰胺类抗生素的方法，该方法包括(i)发酵能够产生所述β-内酰胺类抗生素的微生物，和(ii)回收实质上纯化的形式的所述b-内酰胺类抗生素，其中所述的发酵是在与原始发酵条件下用原始微生物单独发酵时的连接酶活性相比，连接酶活性提高的情况下进行的。

2.按照权利要求1的方法，其中所述的原始微生物缺乏或者仅有较低的连接酶活性。

3.按照权利要求1或2的方法，其中所述的连接酶活性的表达通过调节发酵过程中的物理条件来提高。

4.按照权利要求3的方法，其中所述的连接酶活性的表达通过调节发酵过程的温度来提高。

5.按照权利要求4的方法，其中所述的连接酶活性的表达通过调节发酵过程的pH值来提高。

6.按照权利要求1至5任一之方法，其中所述的连接酶活性通过将微生物置于能诱导连接酶表达的化合物或者试剂中来提高。

7.按照权利要求1至6任一之方法，其中所述的连接酶活性通过干扰发酵微生物的细胞控制机制来提高。

8.按照权利要求1至7任一之方法，其中所述的连接酶活性通过对所述微生物进行修饰来提高。

9.按照权利要求8的方法，其中所述的连接酶活性或者提高的连接酶活性通过所述微生物的随机或特异性定向诱变来获得。

10.按照权利要求1至9任一之方法，其中连接酶活性的表达或连接酶活性的提高的表达的获得包括将至少一个DNA构建体或重组载体的拷贝引入到所述用于发酵的原始微生物中，所述DNA构建体或重组载体包含编码表现出连接酶活性的酶的基因或DNA序列。

11.按照权利要求8至10任一之方法，其中所述的修饰通过氨基酸的取代、缺失或添加来进行。

12.按照权利要求10的方法，其中所述的DNA构建体来源于不同于其被引入的微生物的物种。

13.按照权利要求1至12的方法，其中所述的原始微生物来源于青霉菌属、头孢霉属、曲霉属、诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、Cerospora、小孢囊菌属、其它的真细菌类、其它的放线菌和丝状真菌。

14.按照权利要求13的方法，其中所述原始微生物属于下列物种：产黄青霉、点青霉、顶头孢、构巢曲霉、Nocardia lactamdurans和带小棒链霉菌。

15.按照权利要求1至14任一之方法，其中所述的连接酶活性的表达同步于β-内酰胺类抗生素合成途经的其它基因的表达。

16.按照权利要求15的方法，其中所述的连接酶活性的表达同步于pcbAB、pcbC和/或penDE基因的表达。

17.按照权利要求13或14的方法，其中所述的能够产生β-内酰胺类抗生素的原始微生物选自包含青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、mono-bactams、和诺卡杀菌素类的组。

18.按照权利要求17的方法，其中所述的抗生素是一种头孢菌素或一种青霉素，优选的是青霉素V、青霉素G、V-DCA、G-DCA、7-(L-a-5-氨基-羧基戊酰氨基)-头孢菌酸(异头孢子菌素C)、7-ADCA、或者是7-ACA。

19.按照权利要求8至18的方法，其中在诱导所述DNA构建体表达的条件下培养所述的修饰过的微生物，由此导致产生增加量的相应于所需β-内酰胺类抗生素侧链的羧酸的辅酶A硫代酸酯。

20.按照权利要求8至18的方法，其中在诱导所述DNA构建体表达的条件下培养所述的微生物，由此导致产生活化的侧链辅酶A硫代酸酯，在酰基转移酶(AT)存在下，依次导致形成包含所述侧链的β-内酰胺。

21.按照权利要求1至20的方法，其中所述的连接酶的特征是对苯氧乙酸和苯乙酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍，并且具有由凝胶过滤测定的大约50,000道尔顿的表观分子量。

22.一种表现出连接酶活性的新酶，它对苯氧乙酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍。

23.按照权利要求22酶，该酶对苯乙酸的活性比对乙酸的活性强至少10倍。