[发明专利]用具有提高的连接酶活性的微生物产生β-内酰胺类抗生素的方法

说明书

                       发明所属技术领域

本发明涉及β-内酰胺类抗生素的生物合成，更具体地说，本发明涉及产生β-内酰胺类抗生素的体内和体外方法。

本发明也涉及能够催化β-内酰胺类抗生素生物合成中所涉及的一些步骤的新酶。此外，本发明还涉及编码所述新酶的DNA构建体、包含所述DNA构建体的重组载体或转化载体、以及包含所述DNA构建体或重组载体的细胞。

                       发明背景青霉素的生物合成途径

青霉素的生物合成中的第一步涉及从L-α-氨基己二酸，L-半胱氨酸形成三肽δ-(L-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸(ACV)(Fawcett等，生物化学杂志，157，p.651-660，1976)。反应是由多功能酶δ-(L-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶(ACV合成酶)催化，其中以ATP和Mg为辅因子(Banko等，美国化学会杂志，109，p.2858-2860，1987)。

ACV合成酶(ACVS)已从Aspersillus nidulans(van Liempt等，生物化学杂志，264，p.3680-3684，1989)、顶头孢(Baldwin等，抗生素杂志，43，p.1055-1057，1990)和Streptomvces clavuligerus(Jensen等，细菌学杂志，172，p.7269-7271，1990，和Zhang等，Biotech-nol.Lett.，12，p.649-654，1990)纯化。还未从产黄青霉纯化出ACV合成酶。可是Diez等已从产黄青霉克隆ACV合成酶(生物化学杂志，265，p.16358-16365，1990)。

在异青霉素N合酶(也称作环化酶或者是异青霉素N合成酶(IPNS))、亚铁离子、氧和电子给体(例如抗坏血酸盐)存在下，线性三肽ACV转化成为异青霉素N(IPN)。Ramos等第一次从产黄青霉分离异青霉素N合酶(抗微生物剂和化疗，27，p.380-387，1985)，Carr等克隆了产黄青霉的异青霉素N合酶结构基因(基因，48，p.257-266，1986)。

在青霉素和头孢菌素产生真菌和细菌中，这些青霉素的生物合成的头两个步骤是普遍的。

在一些真菌(例如产黄青霉和A.nidulans)中，异青霉素N的α-氨基己二酰侧链可以被其它细胞内来源的侧链取代或由外源供给。这种交换被酰基转移酶(指酰基-辅酶A：6-氨基青霉烷酸酰基转移酶)催化。

尚非不清楚这种转化是否在体内通过两步反应进行，其中第一步反应除去6-氨基己二酰侧链，产生6-氨基青霉烷酸(6-APA)，其后为酰化步骤，或者转化是侧链的直接交换。从产黄青霉纯化的酰基转移酶具有异青霉素N-酰胺水解酶活性和酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶活性两者(AlvaFez等，抗微生物剂和化疗，31，p.1675-1682，1987)。

编码ACV合成酶(pcbAB)、异青霉素N合酶(pcbC)和酰基辅酶A：6-氨基青霉烷酸的酰基转移酶(penDE)的基因在产黄青霉和A.nidulans的相同族中发现(Diez等，生物化学杂志，265，p.16358-16365，1990，和Smith等，生物技术，8，p.39-41，1990)。

分别编码异青霉素N合酶(IPNS)和酰基转移酶(AT)的产黄青霉Wis54-1255的pcbC-penDE基因簇的扩增导致产率提高高达40％(Veenstra等，生物技术杂志17，p.81-90，1991)。也报道了在包含有多拷贝pcbAB(编码ACV合成酶(ACVS))和pcbC基因(编码异青霉素N合成酶(INPS))的A.nidulans转化体中的增加的抗生素产量(McCabe等，生物技术杂志，17，p.91-97，1991)。

EP200425(Eli Lilly)公开了编码异青霉素N合成酶(IPNS)的载体。所说载体使得在顶头孢和大肠杆菌中高水平表达IPNS。按照公开的内容，所说的头孢属载体对菌株改进来说是有用的，在发酵中增加青霉素和头孢菌素抗生素的效率和产量。所说载体也可以被修饰，产生在发酵中增加产黄青霉和Streptomyces clavuliserus等的产率和效率的载体。