[发明专利]将分子导入细胞溶质

说明书

本发明涉及一种将分子导入细胞的方法，即通过光动力学处理，在不大量杀伤细胞的情况下，破坏核内体和溶酶体膜，将分子导入细胞。

多数分子并不容易通过细胞膜。将分子导入活细胞溶质的方法是调控和研究生物学过程的有用工具。现今，最常用的方法包括显微注射，红细胞血影介导的融合及脂质体融合，胞饮小体的渗透性溶解，刮擦负荷试验，电穿孔，磷酸钙和病毒介导的转染方法。这些技术对于研究培养中的细胞是有用的，尽管在许多情况下并不实际，可能导致时间消耗，无法有效导入或诱导显著的细胞死亡。因此，这些技术对于那些细胞需要保持功能的生物学。医学研究或治疗并不是最好的方法。

众所周知，卟啉及许多其它光敏化合物可诱导对细胞和组织的细胞毒作用。这些作用是根据当光敏化合物在光照情况下会释放单线态氧(′O₂)，单线态氧分解细胞膜和细胞结构，如果损伤广泛，最终会杀死细胞。这种作用已被用于几种肿瘤疾病的治疗。此治疗命名为光动力学疗法(PDT)，先注射一种光敏感的并具有肿瘤定位能力的染料，接着用光照射肿瘤区域。这种细胞毒作用主要是通过单线态氧的形成来介导的。这个活性中间产物在细胞中有一个非常短的寿命(＜0.04μs)。这样，PDT主要的细胞毒作用在光照下被执行，并且非常靠近于′O₂的形成位点。′O₂和蛋白质(组氨酸，色氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，酪氨酸)，DNA(鸟嘌呤)，不饱和脂肪酸，胆固酸反应并氧化它们。PDT的优点之一是未暴露于光下的组织不受影响。有大量的文献关于使用PDT破坏不需要的细胞群如肿瘤细胞。有几个专利涉及到单独使用光动力化合物或者与定向到肿瘤细胞受体决定镁的免疫球蛋白偶联使得复合物更具有细胞特异性。某些光化学化合物，如血卟啉衍生物，而且具有天生浓聚于恶性细胞的能力。这些用于破坏不需要的细胞的方法和化合物在挪威专利号173319，挪威专利申请号90 0731，90 2634，90 1018，941548，85 1897，93 4837，92 4151和89 1491中得到说明。

在PCT/US 93/00683中描述了一种药物运输系统，它包括一种抗肿瘤药和附着于共聚物载体的光激活药物。该复合物在服用后通过胞饮和胞吞作用进入细胞内部，并定位于核内体和溶酶体内部。在溶酶体内，抗肿瘤化合物和聚合物之间的键被水解，前者经溶酶体膜被动扩散到细胞溶质。因此，此方法仅限于能够穿透溶酶体膜的小分子化合物。经过一段时间延迟扩散之后，施用合适的波长和能量的光源激活可光激活的化合物。抗癌药物及可光激的药物的组合效应破坏了细胞，因此，所有已知的可光激活的化合物的使用都是导致广泛地破坏细胞结构以导致细胞死亡。通过定位破坏核内体和溶酶体膜，使不能穿透这些膜的小分子释放进入细胞溶质的方法还尚属未知。

因此本发明的目的在于提供一种将分子转运到培养或组织活细胞中的方法，它是通过：将细胞暴露于可光激活的化合物，能被转送到细胞溶质中的分子(多种分子)，二者的摄取可以被各种载体易化。将细胞暴露于有合适波长和能量的光下以破坏核内体和溶酶体膜，在不破坏大多数细胞的功能的情况下，将分子释放入细胞溶质中，光敏物质和要被转运入细胞溶质的分子可以结合或分别与合适的载体一起施用，任选对目标分子摄取的易化。

本发明达到了以所附权利要求为特征的本发明的目标。

本发明涉及到一种将任何分子转运到活细胞溶质的方法。此后，细胞溶质中可以找到此分子而细胞仍保持功能活性。此方法过程如下：将细胞暴露于可光激活的化合物中，此化合物可被细胞吸收并定位于核内体。溶酶体或其它细胞分隔腔(compartment)内，此可光激活的化合物或者分别与载体分子一起和靶向免疫球蛋白偶联，分子被转运到细胞溶质，并且当细胞暴露于适当波长的光照下时，激活光敏化合物，这样核内体，溶酶体或其它细胞分隔腔膜被破坏，分子释放进入细胞溶质，而未使细胞由于光活化的化合物和核内体/溶酶体内容物的可能作用而失去其功能。

本发明的详细描述及图示如下文：

图1：描述了通过本发明的方法分子如何被导入细胞溶质。光敏物质

 (S)和所选的分子经细胞内吞(I.示启幼内吞过程中质膜的凹

 入)和两种物质终于同一小泡内(II)。当这些小泡暴露于光下

 时，小泡膜破裂，内容物释放(III)；图2：在NHIK 3025细胞中，经gelonin处理，含或不含TPPS2a，光照

 50秒后蛋白质合成情况。符号：○，TPPS_2a+光；●，-TPPS_2a-