[发明专利]三肽基氨肽酶

说明书

本发明涉及一种三肽基氨肽酶(TPAP)，一种编码该TPAP的DNA结构，一种生产TPAP的方法和在不需要TPAP活性的细胞中减少TPAP产量的方法。

三肽基氨肽酶是能够裂解来自肽、寡肽或蛋白质的未取代的N-末端的片段的酶。三肽基氨肽酶可以是非特异性的，即能够裂解来自所述未取代的N-末端的任何三肽序列；或者是特异性的，即能够裂解特殊类型的三肽序列。

此前已报导过来源于动物的三肽基氨肽酶。例如，Doebber等(1978)披露了一种自牛脑垂体中提取的三肽基氨肽酶(Endocrinology103：1794-1804)，已证实其能够裂解来自牛生长激素N-末端的三肽。在Mammalian Protease Vol.2，Exopeptidases(AP 1986，作者：J.K.McDonald和A.J.Barrett)中，披露了分别自牛脑垂体、受孕的猪卵巢和猪脾中提取的三肽基氨肽酶。

Krieger等披露了一种自铅色链霉菌(Streptomyces lividans)66中提取的一种细菌三肽基氨肽酶(Febs Letters Vol.352，No.3，pp 385-388，1994)。Butler等披露了编码所述氨肽酶的基因及其推定的氨基酸序列(Applied and Environmental Micrology，1995年8月，P.3145-3150)。这种肽酶被鉴定为丝氨酸蛋白酶，其最佳pH为7.5～8.5。

众所周知，由微生物生产的制品如酶或其它蛋白的稳定性会变化，特别是受生产所述制品的方法和/或所述制品的来源或微生物生产菌的影响。例如，由微生物生产的制品的稳定性的降低，可能是由对热、光或其它外界条件的抗性的降低所致，或是由所述制品本身的组成所致。就此而言，即使有微量的蛋白酶活性存在于蛋白质制品中也会导致该蛋白制品的稳定性明显下降。不过，通常不能够正确鉴定所述稳定性变化的原因。

本发明人意外地发现，有多种真菌菌种能够产生TPAP，而且，由这些微生物所产生的蛋白制品可能含有微量的TPAP，在某些情况下已发现TPAP能导致该蛋白制品稳定性的降低。本发明人已成功地提取并鉴定了所述TPAP。已证实TPAP能够非特异性地裂解来自蛋白制品的未取代的N-末端的三肽，这种裂解在某些情况下是需要的，但在另一些情况下却很不需要(例如，当导致含有TPAP的蛋白制品的稳定性降低时)。

因此，本发明的一个目的是提供一种可用于裂解肽或蛋白序列的基本纯净的三肽基肽酶。本发明的另一个目的是提供一种生产基本上不含TPAP的蛋白制品的方法，特别是生产那些为TPAP底物的蛋白制品，TPAP的存在会使这种制品的稳定性下降。

在第一个大的方面，本发明涉及一种自真菌中提取的TPAP。具体地讲，TPAP可得自真菌曲霉菌的菌株。另一方面，本发明涉及通过氨基酸和/或DNA序列资料和/或通过酶蛋白特征鉴定的TPAP，涉及编码该TPAP的DNA结构，还涉及这样一种DNA结构：它包括一段与所述编码TPAP的部分DNA序列互补到足于与该序列杂交的程度的核苷酸序列，从而破坏特定宿主细胞的TPAP生产能力。

在另一个重要方面，本发明涉及一种降低产TPAP细胞的TPAP产量的方法，在该方法中，对存在于所述细胞中的、为TPAP表达所必须的一段DNA序列进行修饰或使其失活，以便降低该细胞的TPAP产量。定义

在本文中，“TPAP”用来表示一种氨肽酶，它能裂解来自肽或蛋白序列的N-末端三肽，例如，来自一种伸展蛋白序列，如激素原或酶原中的序列。一般而言，TPAP能够裂解来自肽或蛋白的未取代的N-末端氨基的三肽XYZ，其中，X、Y、Z表示任何氨基酸残基(即：选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)。在TPAP底物中，所有的X、Y和Z可以不同或相同，或者X、Y和Z中有两者相同。应当指出，本发明的TPAP对于被裂解的三肽氨基酸序列来说是非特异性的。在例7中，列举了通过裂解天然存在的肽和蛋白质所获得的三肽产物的具体例子。

在谈及构成本发明DNA结构一部分的DNA序列的来源时所使用的“可获自”一词，是用于表示该DNA序列可以自相关生物的核酸(DNA或RNA)中提取，或以这些材料为基础进行制备。例如，所述DNA序列可以采用本领域已知的方法从由所述生物制备的基因组或cDNA文库中提取，或以这些材料为基础进行制备。