[发明专利]通过与固定化寡核苷酸形成三螺旋纯化DNA的方法

说明书

本发明涉及纯化DNA的新方法。本发明方法能快速分离得到适于药理应用的双链DNA。具体讲，本发明的纯化方法涉及DNA序列与寡核苷酸之间的特异杂交。

基因治疗和细胞治疗技术如今正在迅猛发展。但这些技术涉及能否产生大量药学纯DNA的问题。实际上，在这些新疗法中药物经常由DNA本身构成，所以适量地制备DNA、以适于人体治疗应用的方式分离和纯化DNA的能力是很重要的。

本发明描述一种纯化DNA的简便而特别有效的新方法，这种方法尤其能获得高纯度和高产率。

本发明方法关键在于待纯化的被插入DNA序列与由天然或修饰碱基组成的寡核苷酸之间的特异性相互作用。

最近已表明某些寡核苷酸能够在DNA双螺旋的大沟槽中特异性地相互作用局部形成三螺旋，导致对靶基因转录的抑制(Helene和Toulme，生化生物物理杂志，1049(1990)99)。这些寡核苷酸在寡聚嘌-呤寡聚嘧啶序列水平(即在这样的区域：寡聚嘌呤序列在一条链上，寡聚嘧啶序列在其互补链上)识别DNA双螺旋，并在此局部形成三螺旋。第三条链(寡核苷酸)的碱基与Watson-Crick碱基对的嘌呤形成氢键(Hoogsteen键或反Hoogsteen键)。

现有技术中已描述了此类相互作用在分离质粒中的应用。例如，Ito等(PNAS 89(1992)495)描述了一些生物素化寡核苷酸的应用，这些寡核苷酸能够识别某质粒决定的序列并与其形成三螺旋。这样形成的复合物随后与包有抗生蛋白链菌素的磁珠接触。生物素与抗生蛋白链菌素间的相互作用使得能够通过磁力分离磁珠然后洗脱而分离质粒。但该方法存在一些缺点。特别是需要两种连续的特异相互作用，第一种是寡核苷酸与质粒间，第二种是生物素化复合物和抗生蛋白链菌素珠之间。另外，最终溶液可能被生物素化寡核苷酸污染，而后者不能用于药物组合物中。

本发明描述一种利用这种相互作用的改进的纯化DNA新方法。更具体地讲，本发明方法使用与载体共价偶联的寡核苷酸。该方法特别快，并产生特别高的产率和纯度。另外，本方法能从尤其含有其他核酸、蛋白、内毒素(如脂多糖)、核酸酶等的复杂混合物中纯化DNA。所用载体易于回收，所得DNA具有改善的药物安全性。最后，该方法仅含有一个步骤，不同于现有技术。

本发明的第一个目的在于一种双链DNA的纯化方法，根据该方法，将含有所述DNA和其他成份的混合物溶液在一共价偶联有一寡核苷酸的载体上通过，所述寡核苷酸能够通过杂交与所述DNA中某特定序列形成三螺旋。该特异序列可以是双链DNA上天然存在的序列或人工引入其中的合成序列。

用于本发明的寡核苷酸是与双链DNA直接杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸可含有下列碱基：

-胸腺嘧啶(T)，它能与双链DNA的A-T二联体形成三联体(Rajagogal等，生物化学28(1989)7889)；

-腺嘌蛉(A)，它能与双链DNA的A-T二联体形成三联体；

-鸟嘌呤(G)，它能与双链DNA的G-C二联体形成三联体；

-质子化胞嘧啶(C+)，它能与双链DNA的G-C二联体形成三联体(Rajagogal等，同上)；

-尿嘧啶(U)，它能与A-U或A-T碱基对形成三联体。

优选地，所用的寡核苷酸包含一种富集胞嘧啶的高嘧啶序列，DNA中的特定序列则为一种高嘌呤-高嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得形成酸性pH下稳定的三螺旋，此时胞嘧啶被质子化，而在碱性pH下胞嘧啶被中和，三螺旋不稳定。

为了通过杂交形成三螺旋，寡核苷酸与DNA上的特异序列互补是很重要的。为了获得最佳产率和最佳选择性，在本发明方法中应使用完全互补的寡核苷酸和特定序列。特别可以是：多聚CTT寡核苷酸和多聚GAA特异序列。例如，寡核苷酸序列可以是5＇-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7；(SEQ ID NO.1)，其中碱基GAGG不形成三螺旋，但使寡核苷酸与偶联臂间有一间隔；还可以指出序列(CTT)7(SEQ IDNo.26)。这些寡核苷酸能够与含有互补基元(GAA)的特定序列形成三螺旋。尤其涉及到如实施例中所述包含7、14或17个GAA基元的区域。

另一个具有特异性的序列是如下序列：

5′-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3′(SEQ ID n°5)

该序列与下列寡核苷酸形成三螺旋：

5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID n°6)或

5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID n°7)