[发明专利]人参皂甙产生菌及人参皂甙生产方法

说明书

本发明涉及一种微生物和应用微生物发酵生产人参皂甙的方法。

人参是五加科植物人参(Panaxyginseng C.A.Meyer)的干燥根，原产中国东北，是我国民间最重要的一种补品。在三千年前《神农本草经》及明代《本草纲目》中已有收载，指出人参有补五脏、安精神、止惊悸、明目益智、补血，久服有轻身延年的功效。二千多年来中医用作贵重补药，治疗虚弱病症、用于休克急救、治疗糖尿病等具有比较显著的效果。现代医学研究表明人参对机体功能具有双向调节作用，可抑制和兴奋中枢神精、抗脂质过氧化、对糖的代谢和核糖核酸、蛋白质的合成有促进作用。能促进肝细胞和神经纤维的生长，改善血象，增进性功能及抑制癌细胞生长等作用。

人参的化学成分复杂，公认的主要有效成分是人参皂甙，已确定的结构至少30种以上。按其化学性质可分为3类：齐墩果酸(oleanolic acid)类如Ro，主要有抗炎作用、解毒作用、抗血栓作用；原人参二醇(Protopanaxadiol)类如Rb1和Rb2，表现为中枢抑制、抗低温、降低细胞内钙、抗氧化等作用；原人参三醇(Protopanaxatriol)类如Rg1，表现为中枢兴奋，易化学习记忆，促进蛋白质、DNA和RNA合成，增加海马突触数等作用。Rh2则对瘤细胞增殖有抑制作用[1]。日本学者Shibata、Yahara等人从人参分离出十几种人参皂甙、测定其结构为四环三萜达玛烷型，根据结构特征分Rb、Rg、Ro三组[3-7]。八十年代发现葫芦科的胶股蓝含有Rb1、Rb3、Rd、Rf四种人参皂甙，被誉为南方人参，最近又发现棒锤瓜也含有人参皂甙。但人参或胶股蓝、棒锤瓜均属高等植物，需经一年直至十几年的栽培才能入药，生长周期长、产量低，而且受地理、气候等各种栽培条件限制，数量有限，质量差别也较大。其主要有效成份人参皂甙化学结构复杂，至今尚未能合成成功，仍须从人参的根、茎、叶中提取，以满足研究和医疗的需要[1]，价格昂贵。因此，如何用工业生产的方法获得大量的人参皂甙和人参代用品是人们所企盼的。本发明将使这一愿望变为现实。

一、人参皂甙产生菌的分离与鉴定。

1988年发明人从福建永泰县土壤中分离并提纯获得一丝状真菌，营养菌丝白色，具横隔，分生孢子梗先端具典型的帚状枝，孢子蓝绿色。经鉴定为丛梗孢目(Moniliales)、丛梗孢科(Moniliaceas)、青霉属(Penicillium)，编号Z88(Penicillium sp)。该菌株菌丝生长温度5～32℃，可利用铵态氮、硝态氮，有机氮作为氮源，可利用葡萄糖、蔗糖、淀粉等作为碳源。经多方研究后发现在一定培养条件下，Z88代谢物中含有人参皂甙。经中国专利局检索中心对国内外文献查新结果，只有日本学者通过酶将人参皂甙Rb转为人参皂甙Rd，至今国内外未见有微生物产生人参皂甙的报导。该菌株已于1996年3月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC NO 0257。

二、发酵方法

可采用固体培养：曲盘法或玻璃瓶固体培养；2、液体浅层静止培养；3、液体深层通气培养：生产设备与生产工艺基本与抗菌素同；4、前期用液体深层培养，后期用浅层静止培养或固体培养。四种发酵方式均可获得含有人参皂甙的培养物。培养基可用马铃薯、怀山、大薯、小米、黄豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母膏、糖和麦皮、米糠等配制。pH值4.5～7.0，适宜pH5.5～7.0，培养温度5～32℃，适宜温度15～25℃。液体深层发酵通气量1∶0.5～1，转速50～300转/分钟。本方法区别于现有技术是不是用栽培人参或胶股蓝等植物来获得人参皂甙，而是通过培养微生物，由微生物来生成人参皂甙。

实例1：

培养基配方：去皮马铃薯200～250g(或怀山、大薯均可)，糖20g，K2HPO40.7g、KH2PO4 0.7g，水1000ml。将马铃薯或怀山、大薯切片煮汁、过滤后加入上述其他成分溶化均匀。分装于三角瓶或克氏瓶等容器，使平放后液层厚度1～2厘米。121℃高压灭菌15～30分钟。将Z88(CGMCC NO 0257)菌种接入，振荡均匀后静止培养，20℃条件下培养10天，5～15℃变温条件下培养15～18天。以分生孢子成熟，并发出浓烈人参香味或青草味为结束培养的标志。

实例2：

培养基：马铃薯250g，加水煮汁1000ml(过滤去渣)，加入20g蔗糖和K2HPO4、KH2PO4各0.7g溶化后装入三角瓶，装量以旋转培养液体不溅湿瓶塞为度。20℃180rpm条件下培养3～4天，然后倒入浅盘进行液体浅层静止培养或拌入固体培养基进行固体发酵(具体见实例3)。