[发明专利]丝氨酰组氨酸、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸用作核酸切割剂

说明书

本发明涉及丝氨酰组氨酸、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸用作核酸切割剂的新用途，属生物技术领域。

DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是生物体的遗传物质。对其结构和功能的研究，是分子生物学研究的主要内容之一。要研究核酸结构与功能的关系，就需要对核酸进行各种操作，如对核酸链的切割与连接等。而对核酸链的切割是核酸操作过程中必不可少的过程。目前，用以核酸链切割的核酸切割剂的种类有从生物体中分离的各种天然核酸酶或人工合成的模拟核酸酶以及其他种类的化学试剂。在此，将能够以任何方式断裂核酸链的试剂统称为核酸切割剂。列述如下：

(1)天然核酸酶，即天然存在的具有水解核酸磷酸二酯键功能的酶。

其中限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，其识别序列一般为4或6个碱基对的回文结构，切割产生的片段较短，不易得到完整的基因片段。其它的核酸内切酶和外切酶切割产生的核酸片段则更短。因此，现有的天然核酸酶不能满足研究基因时需定点切割以得到大片段基因簇的要求。

(2)金属及其络合物

a、以自由基机理切割核酸的切割剂：其中包括EDTA-Fe(Ⅱ),Cu(Ⅱ)-硫醇，1,10-二氮杂菲-Cu(Ⅰ)，抗坏血酸-Cu(Ⅱ),Cu(Ⅱ)-Gly-Gly-His,CNBr-甲基硫醚，Mn(Ⅱ)-甲基肼，等。这类切割剂是通过产生自由基而断裂核酸链，会产生活性自由基，本身就会造成对生物体的伤害，不能用于基因治疗。

b、以酯基转移反应机理切割核酸的切割剂：其中包括Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Co(Ⅲ)以及三价镧系金属离子，即(La,Ce,Eu,Gd,Tb,Lu)的胺类络合物。虽然单纯的Ln^a+可以有效促进RNA的切割，但是，必需精心选择合适的配体才能得到有催化活性的金属络合物。另一方面，配体必需是热力学稳定的，又要求在动力学上是惰性的，以防止金属离子的释放。另外，金属络合物同样需要与识别系统偶联才能达到定点切割的目的。因此，要使金属离子能够结合在与合适的识别剂相连的配基上，仍然是一关键。若将金属络合物用于生理条件下的治疗，就更为严格。

c．以水解磷酸二酯键机理切割核酸的切割剂：其中包括Co(Ⅲ)、Ln(Ⅲ)等。目前报道的都需要较高的温度。

(3)含咪唑基的化合物

这类切割剂主要是利用咪唑基作为一般酸碱催化剂达到水解RNA的目的。但不适合用于切割DNA。

本发明的目的是将已有的丝氨酰组氨酸、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸用于核酸切割。天然核酸酶本身数量有限，作用后产生的片段太小；以及以上所述的化学切割剂在应用上存在种种不足，本发明根据天然核酸酶活性中心对核酸的切割机理，利用天然氨基酸、小肽及其衍生物所具有的活性基团，以水解机理切割核酸，从而获得与天然酶解产物相同的水解末端，为应用于分子生物学提供可行性。另外，为了应用于基因治疗、抗病毒、抗肿瘤等，本发明使用的天然氨基酸、小肽及其衍生物，不会带来毒副作用。

本发明的内容是根据天然酶活性中心的结构，设计并合成具DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)切割功能的化合物，属于生物高技术探索领域。本发明采用丝氨酰组氨酸(Ser-His二肽)，磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸的组氨酸溶液切割DNA及RAN。

1、Ser-His切割DNA及RNA

将Ser-His溶于无菌高纯水，配成溶液。将此溶液与切割底物混合，被切割的核酸即切割底物为双链线状DNA(本发明中选用λDNA)、超螺旋质粒DNA(本发明中选用pUC8及pBR322质粒DNA)、RNA(本发明中选用poly和UpolyA)。以20mM(毫摩尔/升)的伯瑞坦-罗比森(Britton-Robison)(由磷酸、乙酸、硼酸组成，其浓度分别为0.04M)缓冲液作为缓冲体系，用氢氧化钠调pH值在4.0-9.0的范围。Ser-His的终浓度为1-200毫摩尔/升(mM)，底物的终浓度为0.05-50mM(按单个碱基的浓度计算)。将Ser-His与底物的混合物置于10-80℃下保温，保温0-96h取出，即完成对底物的切割。将切割后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，RNA采用紫外分光光度法检测，其结果如下：在30℃以下切割现象不明显；37℃时，5mM的Ser-His在保温24h后即有明显的切割现象。随着温度提高或Ser-His浓度的提高，切割速度加快；在50℃保温4h，就有明显的切割现象。在上述pH值范围内，Ser-His都有切割活性。在pH值为7左右时，切割速度最快。

2、磷酰化丝氨酸、磷酰化苏氨酸切割DNA及RNA