[发明专利]Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒

权利要求书

1、一种临床检测Leber氏遗传性视神经病变的试剂盒，其特征在于由抗凝剂、溶血液、一对引物、dNTP、TaqDNA多聚酶、10×Buffer、SfaNI限制性内切酶、NEBuffer3各一管组成，具体为：

(1.1)特定抗凝剂

EDTANa₂  2g

NaCl      0.85g

加水至    100ml

(1.2)一对引物各一管

5′AGCCCTCGTAGTAACAGCCA-3′轻链POS.11641～11660，每微升500纳克。

5GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3′重链POS.11980～11961，每微升500纳克。

(1.3)dNTP

dNTP 200毫微克；

(1.4)TaqDNA多聚酶；

TaqDNA多聚酶1.2单位：

(1.5)10×Buffer

10×Buffer 5微升；

(1.6)SfaNI限制性内切酶

SfaNI(New England Biolabs产)

(1.7)NEBuffer3

NEBuffer3(New England Biolabs产)′

(1.8)溶血液：

Tris-Hcl 10mmol/L.pH7.5

NaCl     10mmol/L，

MgCl₂   5mmol/L。

2、一种临床检测Leber氏遗传性视神经病变的方法，其特征在于依次包括如下步骤：

(2.1)抽取患者外周静脉血1毫升，加入特定抗凝剂100微升中，轻轻摇匀，成抗凝血；

(2.2)取抗凝血50微升置于400微升溶血液中轻轻摇匀，静置5分钟，经4000rpm离心5分钟后弃上清，加入100微升生理盐水混匀，置100℃沸水7分钟，4000rpm短暂离心，取上清10微升作模板；

(2.3)模板10微升中加入一对引物各20pmol，dNTP200毫微克，10xBuffer 5微升，再加双蒸水至50微升，置PCR热循环仪中循环：95℃变性4分钟，待温度按程序自动降至70℃时取出，加入TaqDNA多聚酶1.2单位，然后继续以94℃变性40秒、5 5℃复性40秒、70℃延伸30秒为一个循环，共30个循环，最后72℃继续延伸7分钟，成为经PCR扩增后的特异性DNA片段；

(2.4)取经PCR扩增后的特异性DNA片段20微升，以SfaNI内切酶1个单位和2.3微升NEBuffer3置37℃水浴箱内消化6小时；

(2.5)取步骤(2.4)中最后生成物10微升，加2％溴化乙锭，在电泳仪下分析，正常者呈现190dp、150dp两个片段，而Leber氏遗传性视神经病变患者只呈现340dp一个片段。