[发明专利]Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及人类医学卫生领域，是一种检测Leber氏遗传性视神经病变的方法及其试剂盒。

Leber氏遗传性视神经病变是母系遗传的一种并不少见的眼病。常在青春期发病，男性多见，主要表现为视神经受损，即双眼先后或同时出现中心视力的急剧下降，数月后呈现视神经萎缩。此病的临床症状及眼底表现与急性球后视神经炎、视盘血管炎很相象，因此临床上常易误诊。临床上为明确诊断主要依靠家族遗传史(见：1.《Leber氏病一家四例报告》中华眼科病杂志1993年第9卷第2期；2.《Leber氏家族遗传性视神经萎缩》实用眼科杂志1991年第9卷第11期)，但是有些患者很难问出家族遗传史，另外目前我国实行人口控制，大多数为独生子女，家族遗传史不易显露。到目前为止，还未见有抛开家族遗传史而检测Leber氏遗传性视神经病变的方法。

本发明的目的在于为临床提供一种不需依靠家族遗传史就能检测Leber氏遗传性视神经病变的方法及其试剂盒。

本发明的发明人根据近年来国内外和自己对本病从分子遗传学研究的结果，发现Leber氏遗传性视神经病变的患者存在线粒体的点突变。由于线粒体点突变的存在，使得正常线粒体DNA中人类高度保守的限制性内切酶SfaNI的识别位点丧失。进而，使得线粒体产能效率下降，导致细胞氧化和呼吸功能障碍，尤其是使最易受线粒体产能影响的前部视神经无髓纤维、视神经节细胞的轴突，因细胞供能不足以维持它们的完整结构与功能，最后发生退行性变化。线粒体的点突变被视为与本病致病有关，利用PCR方法检测出线粒体的点突变，就能达到明确检测本病的目的。

本发明提供的检测Leber氏遗传性视神经病变的方法和使用本试剂盒，是在采取患者的1毫升静脉血中，加入特定的抗凝剂，经变性法提取总DNA(包括线粒体DNA)，以PCR方法扩增特异的mtDNA片段，再用SfaNI限制性内切酶切割。正常人，经PCR扩增的产物能被SfaNI限制性内切酶切割，而Leber氏遗传性视神经病变患者，其PGR扩增产物则不能被SfaNI限制性内切酶切割，从限制性内切酶SfaNI的识别位点丧失可查出线粒体的点突变，因而对本病可作明确检测。

下面进一步阐述本发明的具体制备与操作步骤。

本发明的Leber氏遗传性视神经病变检测试剂盒的试剂和溶血液制备或生产单位：

1、特定的抗凝剂：

EDTANa  2g

NaCl    0.85g

加水至  100ml室温溶解，每100微升特定抗凝剂抗凝1毫升静脉血。

2、一对引物：由上海植物生理研究所或上海生物化学研究所提供成品。

5′AGCCCTCGTAGTAACAGCCA-3′轻链POS.11641～11660，每微升500纳克。

5′GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3′重链POS.11980～11961，每微升500纳克。

3、PCR试剂：

dNTP200毫微克

10×Buffer 5微升

TaqDNA多聚酶1.2单位

4、限制性内切酶SfaNI(New England Biolabs产)

NEBuffer3(New England Biolabs产)

5、溶血液：Tris-Hcl 10mmol/L PH7.5 NaCl 10mmol/L，MgCl₂ 5mmol/L.

本发明的Leber氏遗传性视神经检测试剂盒的组成

1、特定的抗凝剂一管

2、一对引物各一管

3、dNTP一管

4、TaqDNA多聚酶一管

5、10×Buffer一管

6、限制性内切酶SfaNI一管

7、NEBuffer3一管

8、溶血液一管

本发明的具体操作方法如下；