[发明专利]与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体

说明书

本发明涉及分子生物学的基因治疗领域。具体地说是关于一类与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体，通过受体介导的内吞作用，将外源DNA靶向性地导入肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。

基因治疗是将外源DNA导入人体的特定细胞以产生治疗效果，达到治疗疾病的目的。为此，首先需具备安全有效的基因转移载体。目前主要有两大类方法可以有效地介导外源DNA转入人体细胞，一类是病毒载体介导的方法，另一类是非病毒载体介导的方法。对属于后者的受体介导的基因转移方法，近年来有所报道。受体介导的基因转移可以通过外源DNA与受体的相应配体结合形成载体来实现。该类载体中的配体可与特定细胞表面的相应受体结合，通过受体介导的内吞作用，将外源DNA转导入特定细胞。Wu.G.Y.等(J.Biol.Chem.，263，14621，1988)报道利用受体介导基因转移将外源DNA转入体外培养的肝细胞，载体中所用的配体是去唾液酸糖旦白，它是用于遗传病基因治疗。Max L.Birnstiel等(P.N.A.S.87，3410-3414.1990)报道利用转铁蛋白与细胞膜表面的转铁蛋白受体结合，经细胞的内吞作用，将外源DNA转导入细胞内，使其获得表达。

此外，这种基因转移载体虽具有靶向性，但有研究提示，通过此种途径被细胞内吞的DNA在向细胞核转移的过程中，必须经过溶酶体，而使载体中的DNA可能被溶酶体内的酶降解，从而使有效转移效率下降。目前已经知道，同时加入某些病毒，例如腺病毒或流感病毒，可提高外源DNA的转移效率。病毒感染宿主细胞时可以避免细胞溶酶体的酶系对DNA降解的原因之一为：某些病毒如流感病毒、腺病毒在感染宿主细胞过程中，当内吞小体形成后，通过病毒外膜的某些蛋白质的结构域与内吞小体的脂质膜作用，破坏内吞小体的膜系统，从而释放出DNA。Max L.Birnstiel等(P.N.A.S.89，6094-6098，1992)报道了利用缺陷型或化学灭活的腺病毒对内吞小体的膜系统的破坏，从而增强转铁蛋白受体介导的基因转移的效率。

为此，本发明的目的是提供一类与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体。该类载体是多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物非病毒载体或是多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体非病毒载体，其中配体多肽是E₅(有14个氨基酸)，GT₆(有16个氨基酸)，GE₇(有16个氨基酸)，GV₈和GC₉；多聚阳离子是多聚赖氨酸或多聚精氨酸；助剂是与流感病毒外膜血凝素氨基端氨基酸序列同源的合成肽HA20或假型逆转录病毒。利用配体多肽识别肿瘤细胞膜上过量表达的生长因子受体，经细胞的内吞作用，通过该载体将外源DNA选择性地转导入肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。

本发明内容主要涉及四个方面，它们分别是：提供与生长因子受体特异结合的多肽；提供多肽/多聚阳离子/外源DNA三元复合体基因转移非病毒载体；提供多肽/多聚阳离子/助剂/外源DNA四元复合物基因转移非病毒载体；上述两种形式的非病毒载体用于活体内外肿瘤的基因治疗。

本发明的第一方面提供与生长因子受体IGF-IIR(胰岛素样生长因子-II受体)，TGFR(转化生长因子受体)，EGFR(表皮生长因子受体)，VEGFR(血管内皮生长因子受体)，CSF-IR(克隆集落生长因子-I受体)特异结合的多肽E₅、GT₆、GE₇、GV₈、GC₉。

某些肿瘤如肝癌、脑瘤、鼻咽癌等，其癌细胞表面的生长因子受体，如IGF-IR、TGFR、EGFR，CSF-IR及瘤内新生血管的VEGFR过量表达。依据配体与受体相互作用的原理，本发明采用电脑图像模拟设计合成了一系列与上述生长因子受体结合的多肽。多肽合成在美国ABI公司的多肽合成仪(Applied Biosystems 430A Pep-tide Synthesizer)上予以完成，合成步骤依据ABI公司多肽合成操作手册进行。多肽合成以后经高压液相色谱纯化得多肽粉末产物。所得多肽产物可经水解分析证实。