[发明专利]新型人肿瘤坏死因子突变体

权利要求书

1、新型人肿瘤坏死因子突变体，其特征在于：

a.nrhTNF基因克隆：

采用亚磷酰胺法合成2条引物，引物1的序列及组成为：

5′GC GAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC 3′

      EcoR I起始码Arg Lys Arg hTNF11-14位氨

                              基酸编码序列

引物2的序列及组成为：

5′CG GACGTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC 3′

      Pst I终止码Phe hTNF156-153位氨

                      基酸编码序列

应用含hTNF cDNA的质粒pBVTNF202为PCR扩增模板，经PCR反应，扩增出一长约470bp的DNA片段。将扩增片段经EcoR I和Pst I双酶切后，克隆入pUC18和pUC19的EcoR I和Pst I酶切位点之间，测定扩增片段的DNA序列，结果表明，该PCR扩增片段与天然人TNF相比较，5′未端缺失了7个氨基酸的编码序列，天然人TNF基因中编码Pro8Ser9Asp10的编码序列由ArgLysArg的编码序列取代，157位Leu的密码子被Phe的密码子取代。

b.高效表达载体的构建

将含人TNF突变基因的pUC19经EcoR I和Pst I双酶切，低熔点琼脂糖回收470bp的DNA片段，插入原核高效表达载体pBV220中。

c.工程菌的建立

宿主菌为大肠杆菌DH5a。将连接好的pBVnrhTNF用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5a株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，LB培养液扩大培养，提取质粒，用EcoR I和Pst I双酶切，筛选出目的菌株。

d.pBV nrhTNF在大肠杆菌中的表达

将经筛选后的pBVnrhTNF/DH5a30℃培养，42℃诱导5小时，菌体经载样缓冲液处理。进行SDS-PAGE电泳，染色，脱色，干胶后扫描分析，在分子量16.5KD左右处有明显表达条带，此带占菌体总蛋白的67.4％。

e.nrhTNF实验室纯化

pBVnrhTNF/DH5a表达菌经诱导后收集菌体。菌体用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)₂SO₄达50％饱和度，上清用10mmol/Tris·Cl pH8.5，1mmol/L EDTA充分透析。粗提液经Q-Sepherose柱层析，0-0.5mol/LNaCl线性梯度洗脱，收集含有nrhTNF的第一峰。透析除盐后，经S-Sepherose柱层析，0-1mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集nrhTNF活性峰，稀释，过滤，分装，冷冻干燥。

2、根据权利要求1所述的新型人肿瘤坏死因子突变体，其特征在于还可将带有此突变体基因的菌株做为工程菌来生产治疗肿瘤的生物药品。