[发明专利]新型人肿瘤坏死因子突变体

说明书

本发明涉及基因工程技术

肿瘤坏死因子(TNF)主要是由巨噬细胞产生的一种非糖基化可溶性多功能细胞因子，由157个氨基酸组成，其主要生物学活性是能够较为特异性地杀伤多种肿瘤细胞，引起肿瘤细胞坏死，这就使得人TNF成为一种潜在的抗肿瘤药物，其开发前景在国内外引起了广泛的重视。但是，临床试验研究表明，全身大剂量应用人TNF可产生严重的毒副作用，而小剂量又难以达到治疗效果。因此，如何提高天然TNF对肿瘤细胞的杀伤活性，降低对组织器官的毒副作用已成为TNF研究的一个重要组成部分，是TNF能否作为抗肿瘤药物应用于临床的关键问题。

本发明应用基因工程技术对TNF基因进行了改造，构建了工程菌，对工程菌表达水平、表达产物的纯度及生物活性均进行了研究，取得了满意的效果，将此工程菌进一步应用到临床可为恶性肿瘤的治疗提供一种安全有效的药品。

本发明的目的是通过以下步骤实现的：

1.nrhTNF基因克隆：

采用亚磷酰胺法合成2条引物，引物1的序列及组成为：

5′GC GAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC 3′

      EcoR I起始码Arg Lys Arg hTNF11-14位氨

                               基酸编码序列

引物2的序列及组成为：

5′CG GACGTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC 3′

      Pst I终止码Phe hTNF156-153位氨

                      基酸编码序列

应用含hTNF cDNA的质粒pBVINF202为PCR扩增模板，经PCR反应，扩增出一长约470bp的DNA片段。将扩增片段经EcoR I和Pst I双酶切后，克隆入pUC18和pUC19的EcoR I和Pst I酶切位点之间，测定扩增片段的DNA序列，结果表明，该PCR扩增片段与天然人TNF相比较，5′未端缺失了7个氨基酸的编码序列，天然人TNF基因中编码Pro⁸Ser⁹Asp¹⁰的编码序列由ArgLysArg的编码序列取代，157位Leu的密码子被Phe的密码子取代。

2.高效表达载体的构建

将含人TNF突变基因的pUC19经EcoR I和Pst I双酶切，低熔点琼脂糖回收470bp的DNA片段，插入原核高效表达载体pBV220中。

3.工程菌的建立

宿主菌为大肠杆菌DH5a。将连接好的pBVnrhTNF用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5a株，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，LB培养液扩大培养，提取质粒，用EcoR I和Pst I双酶切，筛选出目的菌株。

4.pBV nrhTNF在大肠杆菌中的表达

将经筛选后的pBVnrhTNF/DH5a30℃培养，42℃诱导5小时，菌体经载样缓冲液处理，进行SDS-PAGE电泳，染色，脱色，干胶后扫描分析，在分子量16.5KD左右处有明显表达条带，此带占菌体总蛋白的67.4％。

5.nrhTNF实验室纯化

pBVnrhTNF/DH5a表达菌经诱导后收集菌体。菌体用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)₂SO₄达50％饱和度，上清用10mmol/Tris·ClpH8.5，1mmol/L EDTA充分透析。粗提液经Q--Sepherose柱层析，0-0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集含有nrhTNF的第一峰。透析除盐后，经S-Sepherose柱层析，0-1mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集nrhTNF活性峰，稀释，过滤，分装，冷冻干燥。

经菌株稳定性检测，实验室规模发酵、分离纯化后表明：此工程菌株具有良好的稳定性，表达量占菌体蛋白的67.4％。层析纯化后比活性达1×10⁹U/mg蛋白，说明此工程菌株适合于开发生产。

生物活性分析：应用中性红摄入法测定nrhTNF对L929细胞的杀伤活性，结果表明，nrhTNF杀伤活性大于4×10⁸/ml，比活性大于8×10⁸/mg蛋白。

蛋白含量测定：应用Lowry′S法测定nrhTNF蛋白含量约为0.5mg/ml。

纯度分析：SDS-PAGE和HPLC鉴定nrhTNF半成品纯度大于95％。