[发明专利]需氧微生物发酵过程控制菌体代谢节律的培养方法

说明书

本发明涉及一种需氧微生物的培养方法，这个方法是把发酵罐内的Fed-Batch过程看作一个时空混沌体系，在线控制其中的非线性变量，使生物活体的酶促生化反应在节律状态下完成。

在生化工业里典型的菌体培养程序是先在一个种子发酵罐中(体积大约2M³)进行种子培育，种子培养基输送到种子罐中煮沸消毒后，把经过无菌培养过的微生物细胞(菌株)接进罐让它生长，经过一定时间(大约16小时)当细胞数目表明微生物是处于对数生长期时就被输送到主发酵设备开始发酵培养和获取产物，现有技术关于监测和控制都是针对主发酵设备里的发酵生化过程。

主发酵过程一般分为三个阶段，发酵前期是长菌阶段，发酵中期和后期是产物积累和排泄阶段也就是菌体的代谢过程。在需氧微生物的培养过程中，及时准确地调节温度、pH、通风量和流加氮源，碳源，可以控制菌体繁殖、底物消耗速率，提高产物形成速率。迄今为止大多数发酵工业仍采用每几个小时从发酵罐内取出样品，离线进行生化分析，测定菌体浓度、碳源浓度和产物浓度，以便采取相应操作进行过程控制。

欧洲专利EP0661380A2“需氧微生物培养的方法和设备”所介绍的现有技术包括方法和设备，其方法是开发一种在线测量发酵液里的菌体浓度、碳源浓度和产物浓度以及氨离子浓度的方法，根据这些测量值去计算流加速率。定量控制发酵液的碳源浓度和氨离子浓度，使需氧微生物在Fed-Batch培养过程中保持微生物菌的适当生长。实施这个方法的设备包括一台近红外分光光度计和与此仪器相接的计算机以及与计算机相接的控制部件包括温度、pH、流加碳源、罐压和通风。计算机及其控制部件组成一个在线系统。每10分钟自动取一次发酵液，由近红外分光光度计进行在线分析。在线分析的方法是根据校正曲线所提供的经验数据计算：

碳源浓度=32．36+0．900×1295．2×(F[2270]-1019．0×F           [2180]-165．7×F[1982]+848．3×F[2100])

谷氨酸浓度=-4．064+1．079×(-383．2×F[2190]+1233．0×F[2139]             +122．9×F[1982]-998．5×F[2100])

菌体浓度=-1．570+0．321×(-100．1×F[2348]+71．18×F           [2208]+53．83×F[1445]

氨离子浓度=-2．817+0．856×(-846．5×F[1818]+878．6×F              [1778]-15．8×F[2100])根据在线分析的结果确定流加碳源速率：1．当分析结果＞SV+0．2  流加速率=0．8×C源消耗速率2．SV+0．2≥分析结果＞SV+0．1  流加速率=0．9×C3．分析结果=SV  流加速率=1×C4．SV-0．1＞分析结果≥SV-0．2  流加速率=1．1×C5．SV-0．2＞分析结果  流加速率=1．2×C

近红外分光光度计的分析结果输入计算机，计算机按照上述方法计算流加速率，其中SV表示每10分钟大致耗掉多少碳源(这是人为确定的设定值)，碳源消耗速率C是指十分钟前与十分钟时的碳浓度差与时间之比，五种流加速率由计算机确定一种，通过控制器进行流加。

根据上述公式计算的菌体浓度用来确定菌体生长状态，进行温度控制：

初始温度        第一次升温                第二次升温

31．5℃      当菌体浓度≥5．6g／l      当菌体浓度≥8．0g／l

                    36℃                        39℃现有技术对pH、罐压和通气量基本保持在一定值，不进行调节。

现有技术有以下不足之处：

1．现有技术提出的培养方法仅仅是用计算机代替人工取样和输送到近红外分光光度计进行分析计算，在测量发酵液里的菌体浓度和其它浓度的方法方面并没有先进新技术。实际上国内早已采用远红外分光光度计721测定菌体浓度和碳源浓度而用酶膜传感技术测定产物浓度，这些都是经典的方法。