[发明专利]细胞转染

说明书

基因转移技术已成为人们极为关注的一个领域。把一外源基因导入细胞中(即转染)在科学及医学上具有许多重要应用，范围包括从基因调控及重组蛋白质的生产到基因治疗。

病毒已演化得能绕过各种细胞障碍达到基因转移的目的，其实际上已成为转染的选择性载体。目前人们已对多种病毒〔包括逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒〕进行工程处理以携带治疗基因，用于基因治疗中的人类临床尝试。不过，这方面存在着感染及免疫反应上的危险，而病毒的大规模生产既困难又耗时。

由于这些原因，人们便开发出了非病毒性系统来把DNA携带入细胞中，例如依据阳离子脂质(二油酰氧基三甲铵)的转染技术(Felgner等人，Proc.Natl.，Acad.Sci，USA，84，7413-7417，1987)，商用形式为Lipofectin^TM。由于发现了这种转染技术，已经合成出多种阳离子脂质，其中一些已做为可商购转染试剂用于实验室：DOGS(Trans-fectam^TM)、DOSPA(Lipofectamine^TM)、DOTAP(DOTAP^TM)。

尽管如此，虽然在建立非病毒性基因送递系统方面取得了重要的进展，但仍然存在着对更有效技术的需求，因为合成系统的转染效率通常要低于病毒载体的转染效率。另外，在活体应用方面也存在着许多问题，而生物液体中非病毒系统稳定性差也无法保证活体转染的高、可再现水平。

根据本发明我们发现，与脂肪酸部分相偶联的寡肽可以结合核酸、并可用于细胞转染。

因此，一方面，本发明涉及到具下述分子式I的化合物或其衍生物作为用聚核苷酸或任何其它阴离子大分子转染细胞的载体的应用：

                   R¹-NH-A   I

其中，R¹为C_12-40脂族羧酸的酰基部分，而A是缺少一个氨基的寡肽的残基。

术语“C_12-40”指从12-40个碳原子。酰基部分R¹可以是直链或支链、  饱和或非饱和部分。酰基部分R¹优选含12-20个碳原子。这类基团的实例有月桂酰、棕榈酰、硬脂酰、油酰以及(CH₃(CH₂)_n)₂CHCO-，其中n为3-19的整数。最优选者为棕榈酰以及油酰。术语“寡肽”指含氨基酸残基达20个(至少含一个碱性氨基酸)的肽，优选达10个，更优选达2-6个氨基酸残基。术语“衍生物”指寡肽，其中末端羧基被酯化，尤其是形成了低级烷基酯(如甲酯及乙酯)；或者转化为酰胺、低级烷基酰胺或双低级烷基酰胺或酰肼。酰肼为优选衍生物。术语“低级”是指含1-6碳原子的基团。术语“碱性氨基酸”是指所含碱性基团(如氨基、脒基或胍基)比羧基多的氨基酸。这类碱性氨基酸的实例有天然及非天然性的二氨基一元羧酸，如α，β-二氨基丙酸、α，γ-二氨基丁酸，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和对氨基苯丙氨酸。氨基酸可属于L-或D-系列的，也可以是外消旋的，α，γ-二氨基丁酸、赖氨酸及鸟氨酸为具分子式I的化合物的优选氨基酸组分。聚核苷酸的实例为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。除聚核苷酸之外的阴离子大分子实例为蛋白质如核糖核蛋白及用于免疫作用的蛋白质(例如病毒蛋白)。

本发明中所使用的DNA实例为质粒及基因，特别是那些基因治疗方案中已利用的DNA，如囊性纤维化跨膜调节基因(CFTR)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷激酶(tk)及HLA B7；还有报告基因，如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素转移酶以及α-1抗胰蛋白酶。

DNA的其它实例为寡脱氧核苷酸及其用做反义、aptamer或“三螺旋”试剂的类似物。RNA的实例为核酶或寡核糖核苷酸反义分子。

本发明中使用的具分子式I的化合物实例有N^α-棕榈酰-L-赖氨酰-L-赖氨酸及其甲酯及乙酯；N^γ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼；以及N^γ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼。人们已熟知具分子式I的化合物，参见Helv.Chim.Acta.47(1964)P.526-543。

要进行转染的细胞的特性并非要求十分严格。细胞可以是原核或真核细胞、哺乳动物或植物细胞。