[发明专利]编码内-β-N-乙酰基葡糖胺的酶的基因无效
申请号: | 96121962.9 | 申请日: | 1996-10-26 |
公开(公告)号: | CN1153820A | 公开(公告)日: | 1997-07-09 |
发明(设计)人: | 竹川薰;岩原章二郎 | 申请(专利权)人: | 宝酒造株式会社 |
主分类号: | C12N15/56 | 分类号: | C12N15/56;C12N15/63;C12N9/24;C07K14/195;C12P21/00;//C12N15/56;C12R106 |
代理公司: | 中国专利代理(香港)有限公司 | 代理人: | 王景朝 |
地址: | 日本*** | 国省代码: | 暂无信息 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 编码 乙酰 葡糖 基因 | ||
本发明涉及编码具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性之多肽的DNA和利用所述DNA生产具有内-β-N-乙酰基葡糖胺的酶A活性的之多肽的方法。
近几年来,有关称为复合糖(如糖蛋白和糖脂)之分子糖链部分的各种生理功能引起了人们的注意。现在,破坏糖的酶类充当着阐明糖链结构和生物学功能很有用的工具。尤其是内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶催化糖蛋白N-连接的糖链还原末端的二-N-乙酰壳二糖的GlcNAcβ1-4GlcNAc键断裂反应使糖链从所述蛋白质上切掉,并在蛋白质一边留下N-乙酰氨基葡糖,因此该酶已被用于糖蛋白的结构或功能分析。
同样,已知一些形式的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶催化糖链重排反应;特别是已有报道,来自Arthobacter Protoformiae AKU0647菌株的内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶(下文也称为内-A)具有非常强的糖链重排活性(日本专利公开号5-64594)。确切地说,内-A有效地催化其中被切除糖蛋白N-连接的寡甘露糖型糖链并转移至受体糖或复合糖的反应。内-A酶因此而不仅在糖蛋白糖链的结构分析中,而且在诸如复合糖糖链的修饰和新糖蛋白的制备等其它目的中非常有用。
已知形式的内-A来源于Arthrobacter protoformiae[Applied andEnvironmental Microbiology,55,3107,3112(1989)]。
然而,在培养Arthrobacter protoformiae以获得内-A的方法中,同时也产生了蛋白酶和其它的糖苷酶。从内-A中分离和纯化这些共同存在的酶类是很困难的。而且,为了诱导内-A酶的产生,必须在培养基中加入卵清蛋白或糖肽。因此需要开发一种能够以低成本生产高纯度内-A的方法。
尽管已经知道了由Arthrobacter protofomiae纯化内-A的方法(Applied and εnvironmentaeMicrobiology,55,3107-3112,1989),但仍不了解内-A的氨基酸序列或基因结构,因此还没有用基因工程技术生产内-A的方法。
本发明的一个目的是提供含有编码具有内-A活性之多肽的核苷酸序列的DNA。
本发明的目的还在于提供含有编码具有内-A活性之多肽的DNA的重组DNA。
本发明的目的还在于提供含有上述重组DNA作为插入片段的表达载体。
本发明的目的还在于提供携带上述表达载体的转化体。
本发明的目的还在于提供利用本发明的DNA以工业规模生产具有内-A活性多肽的有利方法。
为了阐明内-A的氨基酸序列和编码内-A的核苷酸序列,本发明人生产内-A的菌株(Arthrobacter protoformiae AKU0647)中进行了广泛的研究,并首次成功地确定了该基因的完整核苷酸序列和内-A的氨基酸序列。本发明人还成功地发展了一种在工业水平上利用内-A基因生产内-A的有利方法。基于这些事实,本发明得以完成。
在一个实施方案中,本发明涉及含有编码具有内-A活性之多肽的核苷酸序列的分离或重组DNA,或其功能等同的变异体。
在另一实施方案中,本发明涉及含有本发明的DNA或功能等同变异体的表达载体,该DNA含有编码具有内-A活性之多肽的核苷酸序列,其中所述表达载体能够在原核或真核细胞中繁殖。
在另外的实施方案中,本发明涉及用本发明表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
在另外的实施方案中,本发明涉及生产具有内-A活性多肽或其功能等同变异体的方法,包括下列步骤;
(a)培养将表达载体导入宿主细胞获得的转化体,该表达载体含有本发明的DNA;和
(b)从步骤(a)所得的培养物中回收具有内-A活性的多肽或其功能等同的变异体。
内-A的完整氨基酸序列和编码所述酶之基因的核苷酸序列由本发明首次提出,因此,通过重组DNA技术能够有利地进行具有内-A活性多肽的工业规模生产。
图1表示经PCR扩增的DNA片段之限制性酶切图。
图2表示3kb ClaI插入片段和2.5kb HindIII/PstI插入片段的限制性酶切图。
图3表示内-A的Western印迹分析结果。
本文所使用的术语内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶被定义为具有“应用和环境微生物学”(Appied and εnvironmental Microbiology,55,3107-3112,1989)所述的下列理化特性:1.作用
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