[发明专利]稳定的酯水解生物催化剂

说明书

本申请要求下列申请的优先权：美国专利临时申请，1996年6月12日申请号No.80/_______；1995年1月10日申请号No.80/009,704；以及1995年8月7日申请号No.80/001,995。以上各申请引入本文作为参考。政府权利声明

本申请中公开的工作，部分由NIH-SBIR给予ThermoGen Inc.的许可号NCI1-R43-CA63876-01的支持，因此美国政府在此发明中可能有些权利。

本发明的领域

本发明的涉及领域为分离的适于商业化医药和化学合成的酶应用的稳定生物催化剂，用于产生重组酯水解蛋白的DNA载体，由此载体转化的宿主细胞，以及由此载体和转化细胞产生的重组酯水解蛋白等方面。

本发明的背景

酯酶和脂肪酶。酯酶和脂肪酶可如下所示催化酯键水解产生醇和羧酸。

酯酶和脂肪酶在不同底物专一性，R基团或链长偏爱，以及独特抑制剂(1,2)上有区别。多种酯酶和脂肪酶包括诸如优先水解具长碳链R基团酯的广泛的羧酸酯酶，胆碱酯酶，以及对非常特异的底物起作用的乙酰酯酶等水解酶。已知在很多情况下这些水解酶还表现出源于蛋白质活性位点固有的手性特征的立体或区域选择性偏爱。这种偏爱的水解活性使它们可用于需不同区域选择性和立体选择性的反应或对外消旋混合物的动力学拆分方法中。对表现出立体选择性的酶，如果R^*是外消旋混合物，酶催化水解的产物R₁是最快水解的立体异构体，而命名为R^*′的剩余酯是与任何残余R₁混在一起的富集对映体。然后通过色谱方法分离产物产生纯的R₁。具不同特异性的酯酶和脂肪酶大库的存在将可用于筛选用于特异反应的酶以及开发对特异化学合成的最优方法。此方法的便利之处将便于许多有用的药物产品的大规模生产。

在水溶剂系统中，酯酶和脂肪酶实现其天然反应：酯键的水解。在体外，这些酶可用于对多种底物进行反应，包括含环或无环醇的酯，单和二酯，以及内酰胺(3)等。在排除水的有机溶剂(4,5)中进行反应时，酯酶和脂肪酶的反应可逆转。这些酶可催化酯化或酰化反应以形成酯键(3,6,7)。此方法亦可用于酯的酯基转移以及闭环或开环反应。

光学纯手性药物。目前，大部分合成的手性药物以消旋混合物出售。但是，由于光学纯(单异构体)手性化合物合成的发展，这种情形正在改变(7)。消旋药物通常含有一个治疗活性的异构体和另一个最好情况是无活性以及最坏情况下是潜在有害副反应的主要原因的对映体。消旋药物中无用的异构体越来越被认为是污染物。实际上，FDA的新药开发策略报告书建议“应说明每一异构体在动物中的药物动力学曲线特征以及以后与Ⅰ期临床实验中得到的临床药物动力学曲线相比较”药物实验(8)。因此，药物公司将需开发合成或分离路线以产生每种新的合成药物的各纯化异构体。

光学纯药物和中间产品的酶法合成。由于通过经典化学合成常常难以产生特定手性分子的光学纯溶液，新的酶法生物催化剂将在这种努力中起着重要作用。在某些情况下，酶能够用对环境更友善的生物学合成方法代替危害性的化学合成方法。如果一种酶一次能消除多种化学保护和去保护步骤，这样产生药物中间产品也是非常节省费用的(7)。如许多详细的综述中所述(3,7)，所有六种酶的主要类别(氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，裂合酶类，异构酶类，以及连接酶类)均可用于光学纯化合物的合成。由于水解酶类及其信息的丰富性，它们对辅助因子的非依赖性，以及它们对各种底物的可接受性，水解酶已证明是最有用的一类酶。

文献调查显示许多用于化学合成或手性拆分的亲中介态的水解酶特别是酯酶和脂肪酶的实例。它们包括来自猪(9,10)和马(3)肝的酯酶和多种来自曲酶(11)，含珠菌(12-16)，假单胞杆菌(17-19)，酒曲菌(20)及其它的脂肪酶。已将多种脂肪酶用于合成普萘洛尔(7)，一种用于治疗绞痛(angia)和高血压的β-肾上腺素能阻断剂。已使用羧酸酯酶通过立体选择性水解其甲酯合成了一种非甾体(nonstearoidal)消炎药物，布洛芬(Ibup rofen)(7)。当这些酶开始证明生物催化剂在化学合成中的应用时，还非常需要具有不同底物特异性，区域选择性和立体选择性的多种酯酶和脂肪酶。此外，由于这些酶需要用于大规模工业装置，需使它们具有更强的稳定性，更高的热耐受性和更长的“保质期”。