[发明专利]稳定的外部指导序列

说明书

                     本发明的背景

本申请涉及设计成以RNA酶P进行RNA靶裂解的方法和外部指导序列组合物。

I.核酶和外部指导序列分子

核糖核酸(RNA)分子不仅可用作遗传信息的载体，例如，基因组逆转录病毒RNA和信使RNA(mRNA)分子，和作为蛋白质合成所必需的结构，例如，转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)分子，而且还可作为特异性地裂解核酸分子的酶。该催化性RNA分子称为核酶。

于1989年获得诺贝尔奖的Altman和Cech博士发现的催化性RNA在商业上的应用，特别是在治疗上引起了极大的兴趣(Altman，Prac.Ntl.Acad.Sci.USA 90：10898-10900(1993)；Symons，Annu，Rev.Biochem.61：641-671(1992)；Rossi等，Artisense Res.Dev.，1：285-288(1991)；Cech，Annu Rev.Biochhem.59：543-568，(1990))。已描述了催化性RNA(核酶)的一些类别，包括来自内含子核酶(WO88/04300，也见Cech.T.，Annu.Rev.Biochem.，59：543-568，(1990))，锤头状核酶(WO89/05852和EP321021，GeneShears)，斧头状核酶(WO91/04319和WO91/04324，Innovir)。

RNA酶P

另一类核酶包括酶的RNA部分，RNA酶P，它涉及转移RNA(tRNA)，蛋白质合成机制中的一种常见的细胞成份的加工。细菌RNA酶P包括2种成份，蛋白质(C5)和RNA(M1)。Sidney Altman及其合作者证实了M1 RNA能象完整的酶一样发挥功能，显示了在大肠杆菌中，RNA是必需的催化成份(Guerrier-Takada等，Cell 35：849-857(1983))。在随后的工作中，Altman博士和同事经过使用一种外部指导序列(EGS)建立了用于将实际上任意RNA序列转变成细菌RNA酶P的底物的方法，EGS在其5′端具有至少7个核苷酸互补于所要裂解的RNA3′至裂解位点的核苷酸，且在其5′端具有核苷酸NCCA(N是任意核苷酸)(WO 92/03566和Forster和Altman，Science 238：407-409(1990))。使用相似的原理，建立了用于真核系统的EGS/RNA酶P介导的RNA裂解，(Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8006-8010(1992))。本文使用的“外部指导序列”和“EGS”指在靶RNA中形成RNA酶P活性裂解位点的任意寡核苷酸。

II.乙肝病毒(HBV)

HBV，引起肝脏持久性非细胞致病性感染的一组含DNA的小病毒中的一个成员是在全世界发现的人感染原，它永久存在于慢性携带者的大型人类群体中。估计占地球人口大约6-7％受到了感染(3亿携带者)。在全世界该感染的流行率不均匀。HBV的分布有一个地理梯度。在北美和西欧最低，在那里该病毒可检测到占人口的0.1到0.5％，而在东南亚和近撒哈拉的非洲地区最高，那里感染率可占人口的5％到20％。这种倾斜的分布与肝细胞癌相平行，且提供了慢性HBV感染与这类恶性肿瘤之间相联系的有力的流行病学证据。

乙型具有极大的医学重要性，因为它可能是慢性肝脏疾病包括人类肝细胞癌的最常见的起因。感染的肝细胞不断分泌在血液中高水平积累的病毒颗粒。这些颗粒有两类：(i)非感染性颗粒，由过剩的病毒衣壳蛋白(HBsAg)组成且不含核酸(浓度达到10¹³个颗粒/ml血液)，和(ii)感染性的，含DNA的颗粒(Dane颗粒)，由周围装配有含主要病毒衣壳蛋白，碳水化合物和类脂的27nm核衣壳核心(HBcAg)组成，以较低浓度存在(10⁹个颗粒/ml血液)。人乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒家族的一个成员，与其亲缘关系较近的包括土拨鼠肝炎病毒(WHV)，鸭肝炎病毒(DHV)，和松鼠肝炎病毒(GHV)(Robinson(1990))。与逆转录病毒一样，嗜肝DNA病毒对其3.2kb DNA基因组进行逆转录(Pugh(1990))。乙肝病毒基因是环型且部分为单链，含有不完全的正链。不完全的正链与病毒颗粒中的DNA聚合酶复合，显示出使用完全质链为模板延伸正链。这些形态学和结构特征使乙肝病毒区别于所有已知的含DNA病毒的类型。