[发明专利]表达降低水平的金属蛋白酶的宿主细胞和在蛋白质产生中使用该宿主细胞的方法

权利要求书

1.一种对表达异源蛋白质产物有用的宿主细胞，为了表达与亲本细胞比较明显降低水平的金属蛋白酶，该宿主细胞已经遗传修饰过。

2.按照权利要求1的宿主细胞，该细胞是酵母细胞。

3.按照权利要求2的宿主细胞，该细胞是酵母属的菌株，优选的是啤酒酵母。

4.按照权利要求1的宿主细胞，该细胞是丝状真菌。

5.按照权利要求4的宿主细胞，该细胞是选自顶孢霉属、曲霉属、假丝酵母属、Cocliobolus、内座壳属、镰孢属、腐质霉属、链孢霉属、根毛霉属、根霉属、Thermomyces、木霉属、柄孢壳属、Pyricularia和青霉属的菌株。

6.按照权利要求5的宿主细胞，该细胞是选自由米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、泡盛曲霉、海枣曲霉、日本曲霉、Aspergillus foetus、禾谷镰孢、尖镰孢、腐皮镰孢、灰腐质霉、粗糙链孢霉、产黄青霉、Rhizomucormeihei、Trichoderma reesei和绿色木霉的菌株。 

7.按照任何权利要求1-6任一之宿主细胞，其中所说的金属蛋白酶是镰孢属金属蛋白酶。

8.按照权利要求7的宿主细胞，其中所说的金属蛋白酶是尖镰孢金属蛋白酶。

9.按照权利要求8的宿主细胞，其中所说的金属蛋白酶是具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列或其同源序列的尖镰孢p45金属蛋白酶。

10.按照权利要求1-6任一之宿主细胞，其中所说的金属蛋白酶是中性金属蛋白酶，该蛋白酶具有在pH6-8范围内的最佳蛋白酶解活性。

11.按照权利要求10的宿主细胞，其中所说的金属蛋白酶是NpI或NpII组的中性曲霉属金属蛋白酶。

12.按照权利要求11的宿主细胞，其中所说的金属蛋白酶是米曲霉中性金属蛋白酶I(NpI)，该蛋白酶由包含SEQ ID NO：4所示的部分核苷酸序列或其同源序列之cDNA序列编码。

13.按照权利要求1-12任一之宿主细胞，该细胞的编码金属蛋白酶的结构区或调节区已经遗传修饰过。

14.按照权利要求13的宿主细胞，该细胞已由特异性或随机诱变；PCR产生的诱变；定点DNA缺失、插入和/或取代；基因破裂或基因置换技术；反义技术或它们的组合遗传修饰过。

15.按照权利要求1-14任一之宿主细胞，在该细胞中表达的金属蛋白酶的水平降低约50％以上，优选的约85％以上，更优选的约90％以上，最优选的约95％以上。

16.按照权利要求1-14任一之宿主细胞，该细胞基本上无任何金属蛋白酶活性。

17.一种用权利要求1的宿主细胞产生异源蛋白质产物的方法，该方法包括：

(a)将编码所说蛋白质产物的核酸序列引入到所说的宿主细胞中；

(b)在合适的生长培养基中培养步骤(a)的宿主细胞；和

(c)分离所说的异源蛋白质产物。

18.按照权利要求17的方法，其中所说的宿主细胞是酵母细胞。

19.按照权利要求18的方法，其中所说的宿主细胞是酵母属的菌株，优选的是啤酒酵母。

20.按照权利要求17的方法，其中所说的宿主细胞丝状真菌。

21.按照权利要求20的方法，其中所说的宿主细胞是选自由顶孢霉属、曲霉属、假丝酵母属、Cocliobolus、内座壳属、镰孢属、腐质霉属、链孢霉属、根毛霉属、根霉属、Thermomyces、木霉属、柄孢壳属、Pyricularia、和青霉属的菌株。

22.按照权利要求21的方法，其中所说的宿主细胞是选自由米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、泡盛曲霉、海枣曲霉、日本曲霉、Aspergillus foetus、禾谷镰孢、尖镰孢、腐皮镰孢、灰腐质霉、粗糙链孢霉、产黄青霉、Rhizomucor meihei、Trichoderma reesei和绿色木霉的菌株。

23.按照权利要求17-22的方法，其中所说的金属蛋白酶是镰孢属金属蛋白酶。