[发明专利]表达降低水平的金属蛋白酶的宿主细胞和在蛋白质产生中使用该宿主细胞的方法

说明书

                        技术领域

本发明涉及新的宿主细胞和产生蛋白质的方法。更具体地说，本发明涉及对表达异源蛋白质有用的宿主细胞，为了表达明显降低水平的金属蛋白酶，该宿主细胞已经遗传修饰过。此外本发明涉及产生异源蛋白质的方法，该方法包括在适当的生长培养基中培养所述宿主细胞，接着回收所需蛋白质。

                        背景技术

近年来在表达异源蛋白质中重组宿主细胞的使用大大简化了商业上有价值的许多蛋白质的产生，这些蛋白质原来仅仅可以通过从它们的天然源纯化产生。当前，有用来产生任何给定的蛋白质的多种供选择的表达系统，包括真细菌和真核宿主。对一个适当的表达系统的选择常常不仅取决于宿主细胞产生足够量的活性状态蛋白质的能力，而且在很大程度上受制于蛋白质的最终用途。

经常遇到的一个问题是给定的宿主细胞产生的或在培养基中的高水平的蛋白酶。已有人提出人们可以提供丧失了产生特异性蛋白酶解化合物能力的宿主生物体。例如，国际专利申请WO 90/00192描述了不能分泌酶活性天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主；EP 574 347描述了缺失枯草杆菌蛋白酶-型丝氨酸蛋白酶的曲霉属宿主。

金属蛋白酶已经从许多真核源分离到。也已报道了从曲霉属菌株分离的中性金属蛋白酶，即，在中性pH时具有最佳活性的金属蛋白酶。中性金属蛋白酶被分成两组：NpI和NpII[Sekine，农业生物化学，1972 36 207-216]。最近公开了来源于米曲霉的中性金属蛋白酶II cDNA的核苷酸序列[Tatsumi H，Murakami S，Tsuji RF，Ishida Y，Murakami K，Masaki A，Kawabe H，Arimura H，Nakano E和Motai H；Mol.Gen.Genet.1991 22897-103]。从未公开过来源于米曲霉的中性金属蛋白酶I cDNA的核苷酸序列。

虽然金属蛋白酶已被报道，但从未描述过它们与降低从这些生物体所获产物的稳定性的关系。

                         发明概要

按照本发明，现已发现金属蛋白酶可以明显地降低从细胞获得的产物的稳定性。

因此，本发明提供了对异源蛋白质产物的表达有用的宿主细胞，为了表达明显降低水平的金属蛋白酶，该宿主细胞已经遗传修饰过。

另一方面，本发明提供了一种在宿主细胞中产生异源蛋白质产物的方法，该方法包括将编码所说蛋白质的核酸序列引入到所说的宿主细胞中，在适当的生长培养基中培养所述宿主细胞，并分离所说的异源蛋白质产物。

通过本发明的方法，金属蛋白酶产生的蛋白酶解作用被明显减小，由此改善了由所述方法获得的蛋白质的稳定性。此外，用本发明的方法获得的蛋白质可以以下列形式获得：前体蛋白(即酶原)，杂合蛋白，作为原(pro)序列或原-前(pre-pro)序列或者以非成熟形式获得的蛋白质。

                       附图简要描述

参照附图进一步说明本发明，在附图中：

图1显示质粒pSO2的图谱，参见实施例2；

图2显示米曲霉菌株HowB101的构建，参见实施例2；

图3显示质粒pJaL335的构建，参见实施例2；

图4显示质粒pJaL399的构建，参见实施例2；

图5显示质粒pJaL218的构建，参见实施例4；和

图6显示质粒pToC56的图谱，参见实施例5。

                         发明详述宿主细胞

本发明提供了对表达异源蛋白质有用的宿主细胞，与亲本细胞比较，为了表达明显降低水平的金属蛋白酶，该宿主细胞已经遗传修饰过。

所述亲本细胞是所说宿主细胞的来源。它可以是野生型细胞。此外，除在金属蛋白酶水平上降低之外，它可以在另一方面被遗传改变。