[发明专利]病毒载体及其在治疗过度增殖性疾病(特别是再狭窄)上的用途

说明书

本发明涉及用于通过基因疗法治疗与过度增殖性疾病有关的病理状态的新的特别有效的方法。更具体地说，按照本发明的方法包括通过gax基因的体内转移特异性地阻止血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖。本发明的方法尤其适于通过在血管壁中gax基因的过度表达治疗血管成形术后的再狭窄。按照本发明，gax基因可以通过病毒载体转移。这些载体优选地是腺病毒载体。

已分离了与阻止细胞分裂相联系的各种基因。这样，gas(阻止生长特异性的：gas1-6)和gadd(阻止生长和DNA可诱导损坏：gadd34、gadd45和gadd153)基因在静止细胞中强烈表达，其中静止细胞是在细胞周期的G0期被阻止的细胞(Schneider等，细胞，1988，54：787-793，Del Sal等，细胞，1992，12：3514-3521；Cowled等，细胞研究快报，1998，211：197-202；Brancolini和Schneider，细胞生物学杂志，1994，124：743-756；Zhan等，分子细胞生物学，1993，13：4242-4250；Jackman等，癌症研究，54：5656-5662，1994)。和这些基因表达的研究结果一致，gas-I蛋白质的微注射阻止DNA的合成(Del Sal等，细胞，1992，70：595-607)。相反地，生长因子(如PDGF(血小板衍生生长因子))或小牛血清的添加在体外模型中减少这些基因的表达(Coccia等，分子细胞生物学，1992，12：3514-3521)。这种与细胞增殖状态有关的表达特异性在体内也似乎有其对应性。这样，在卵巢切除术之后gas-1基因在大鼠子宫中强烈表达(Ferrero和Cairo，Cell.Biol.Int.，1993，17，857-862)。在相同的动物模型中，用雌激素治疗导致细胞增殖，这一点在子宫内原癌基因C-myc的表达增加中反映出来或者由gas-1基因表达的减少2所反映。同样地，在增殖/再生的肝模型中，在部分的heptatectomy(即在从G0期向G1期过渡期间)四小时之后，gas-6的基因表达严重地减少。这种表达可能在肝细胞的一次分裂启动后恢复正常(Ferrero等，细胞生理学杂志，1994，158：263-269)。

申请人对新的基因，即gax(阻止生长特异性同源框)基因感兴趣，而且现在证明这种基因具有用于治疗过度增殖性疾病(特别是再狭窄)的基因治疗中的特别有利的性质。gax基因最初从大鼠主动脉中制备的cDNA文库中鉴别。它编码303个氨基酸的蛋白质。已经对其序列进行了特征分析，而且克隆了其cDNA(Gorski等，分子细胞生物学，1993，6，3722-3733)。gax基因具有某些和gas与gadd基因的性质类似的性质，因为看来它也可以调节细胞周期中的G0至G1过渡。按相同的方式，在与PDGF接触两小时之后，在大鼠VSMCs中通过因子10降低gax mRNA的水平(Gorski等，分子细胞生物学，1993，6，3722-3733)。因此gax基因的表达在VSMC致有丝分裂的反应期间被抑制。

按照本发明的方法的一个优点主要是gax基因的特异性表达。这样，在成年大鼠中，gax基因主要在心血管(主动脉和心脏)系统中表达。另一方面，Northern印迹不能证明gax mRNA在肝、人脑、胃或骨骼肌中的存在。血管成形术后的再狭窄是局部的过度增殖性疾病，这种疾病在动脉硬化症血小板区域中的非手术治疗之后出现。这样，通过血管成形术治疗动脉硬化症损伤在对动脉壁机械伤害之后经常导致(在某些研究中可多达50％的病例)再狭窄。在这种机制中的关键事件是膜血管中层的平滑肌细胞(VSMC)向膜内膜的增殖和迁移，具体来说是无由于通过膜内膜的内皮细胞操作的保护和/或反馈。在VSMC细胞中有选择地表达按照本发明的抗增殖基因的能力代表了非常实质性的优点。

按照本发明的方法的另一个优点也在于这样的事实：gax基因属于血液基因家族。这些基因编码包含共有序列(或血液结构域(homeodomains))的转录因子，该共有序列识别DNA的特异性区域(或同源框)(综述：Gehringal等，细胞，78：211-223，1994)。大鼠gax蛋白质的同源结构域包含在氨基酸185和245之间。另人感兴趣的是，目前为止鉴别的血液基因参与胚胎发生期间细胞分化/生长的控制，这样就增强了按照本发明的方法的治疗潜力(综述：Lawrence和Morata，细胞，78：181-189，1994；Krumlauf，细胞：78：191-201，1994)。