[发明专利]表达胆汁盐刺激脂酶(BSSL)的DNA分子

说明书

技术领域

本发明涉及用于在甲基营养酶母巴斯德毕赤酵母中表达胆汁盐刺激脂酶(BSSL)的方法中的DNA分子，重组载体和细胞培养物。背景技术

胆汁盐刺激脂酶(BSSL；EC3.1.1.1)(综述见Wang和Hartsuck，1993)提供大部分人乳汁脂裂解活性。该脂酶的一个特点是需要初级胆汁盐来提供抗乳化的长链三酰基甘油的活性。至今为止，仅在来自人，大猩猩，猫和狗的奶中发现了BSSL(Hernell等，1989)。

BSSL在母乳喂养婴儿的肠中的乳汁脂肪的消化中起着关键性的作用(Fredrikzon等，1978)。BSSL在人分泌乳汁的乳腺中合成并随乳汁一起分泌(Bickberg等，1987)。它占全部乳汁蛋白的约1％(Blckberg和Hernell，1981)。

已认为BSSL是脂肪吸收和随后的生长中主要速率限制因素，尤其是未成年的在其自身合成BSSL有缺陷的婴儿。补充纯化酶的办法明显改善了这些婴儿的消化和生长(U.S.4,944,944；Oklahoma医学研究基金)。这在制备含有高百分比的三甘油酯和基于植物或非人类乳汁蛋白来源的婴儿配制剂的生产中具有临床学重要性，因为用这些配制剂喂养的婴儿在没有外加的BSSL时不能消化脂肪。

已鉴定出乳汁BSSL和胰羧酸酯水解酶(CEH)的cDNA结构  (Baba等，1991；Hui和Kissel，1991；Nilsson等，1991，Reue等，1991)，并已作出结论，即乳汁酶和胰酶为相同基因，CEL基因的产物。CEL基因的cDNA序列(SEQ ID NO：1)公开在US5,200,183(Oklahoma医学研究基金)；WO 91/18293(Aktiebolaget Astra)；Nilsson等(1990)；和Baba等(1991)中。推测的BSSL蛋白的氨基酸序列，包括23个氨基酸的信号肽，示于序列表中的SEQ ID NO：2，同时722个氨基酸的天然蛋白质的序列示于SEQ ID NO：3。

蛋白质的C末端区含有各为11个氨基酸残基的16个重复单元，接着是11个氨基酸的保守区段。天然蛋白质为高度糖基化，并已报道了宽范围的观察到的分子量。这可通过糖基化的变化程度来解释(Abouakil等，1988)。该的N末端的一半与乙酰胆碱酯酶和一些其它的酯酶同源(Nilsson等，1990)。

可通过在适宜宿主，例如大肠杆菌，啤酒糖酵母或哺乳动物细胞系中的表达来制备重组BSSL。为了扩大这种制备费用为商业上可接受的BSSL表达体系，可设想使用异源表达体系。如上面所提到的，人BSSL在C末端具有11个氨基酸的16个重复单元。为了确定这一重复区域的生物重要性，已构建了部分缺少或全部缺少重复区的人BSSL各种突变体(Hansson等，1993)。变异体BSSL-C(SEQ ID NO：4)，例如缺失氨基酸残基536-568以及残基591-711。使用哺乳动物细胞至C127宿主和牛乳头状瘤病毒表达载体的表达研究表明各种变异体可以活性形式表达(Hansson等，1993)。从表达研究中还可总结出人BSSL中的富含脯氨酸的重复对于BSSL的催化活性或胆汁盐活性是非必需的。然而，在哺乳动物表达体系中制备BSSL或其突变体对于常规治疗用途来说可能太昂贵。

与使用原核体系相比，真核体系，例如酵母对于制备由重组DNA编码的一些多肽可提供明显的优点。例如，酵母可通常比细菌生长的细胞密度高，并可证实能糖基化表达的多肽，而这种糖基化对于生物活性是重要的。然而，使用啤酒糖酵母作为宿主器官通常导致不良的表达水平和重组蛋白的不良分泌(Cregg等，1987)。啤酒糖酵母中的异源蛋白质的最高水平为占全部细胞蛋白质5％的范围(Kingsman等，1985)。使用啤酒糖酵母作为宿主的另一个缺点是重组蛋白质可能被过度糖基化，这样可能影响糖基化的哺乳动物蛋白质的活性。

巴斯德毕赤酵母是以甲醇作为唯一碳源和能源而生长的甲基营养酵母，因为它包含高度调控的甲醇利用途径(Ellis等，1985)。毕赤酵母还可适合于有效的高细胞密度发酵技术。因此，重组DNA技术和有效的酵母转化的方法使得有可能开发巴斯德毕赤酵母作为使用基于甲醇氧化酶启动子的表达体系高产量地表达异源蛋白质的宿主(Cregg等，1987)。