[发明专利]TNF－α转变酶

说明书

发明领域

本发明涉及纯化和分离TNF-α转变酶，这种酶的核酸序列、产生重组TNF-α转变酶的方法，含有这种酶的药物组合物及它们在各种测定和治疗方面的用途。

发明背景

肿瘤坏死因子-α(TNF-α，也称作恶液质素)是一种可诱导对多种细胞类型产生各种效应的哺乳动物蛋白质。TNF-α最初的特征是可以裂解肿瘤细胞，其可由激活的细胞如单核吞噬细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞和NK细胞产生。TNF-α有两种形式，相对分子量为26000(26kD)的Ⅱ型膜蛋白和可溶的17kD的通过蛋白酶裂解从细胞结合蛋白质上产生的形态。TNF-α是宿主对革兰氏阴性细菌应答的主要介体。从革兰氏阴性细菌细胞壁产生的脂多糖(LPS，也称作内毒素)是TNF-α合成的有效刺激剂。由于由TNF-α的过量生成或增量调节地生成导致的毒性非常严重，因此进行了相当的努力来控制或调节血清中TNF-α的水平。这些有效控制血清TNF-α水平中的重要部分是掌握TNF-α生物合成的机理。

分泌TNF-α的机理以前没有人提出。Krieght等人在“细胞”53:45(1988)中推测TNF-α的“分泌”是由于26kD膜结合分子被一个未知的蛋白裂解酶或蛋白酶转变而产生的。Scuderi等人在“免疫学杂志”143:168(1989)中提出，TNF-α从人的白细胞中释放与一种或多种丝氨酸蛋白酶如白细胞弹性蛋白酶或胰蛋白酶有关。发现一种丝氨酸蛋白酶抑制剂即对-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯可以浓度依赖的方式抑制人白细胞TNF-α的释放。Scuderi等人提出精氨酸甲酯竞争结合酶活性中心的精氨酸结合位点，因此抑制了水解。抑制剂的赖氨酸和苯丙氨酸类似物据报道没有精氨酸甲酯那样的活性。然而，从来没有显示该化合物是通过抑制裂解26kD TNF的蛋白酶而发挥作用。最近，有报道金属蛋白酶抑制剂抑制TNF从THP-1细胞中的释放。参见Mohler等人，“自然”370:218(1994)；Gearing等人，“自然”370:555(1994)；和McGeehan等人，“自然”370:568(1994)。

大多数(并非所有)蛋白酶识别特定氨基酸序列。一些蛋白酶主要识别位于断裂键的N末端的残基，一些蛋白酶识别位于断裂键的C末端的残基，一些蛋白酶识别位于断裂键的两边的残基。金属蛋白酶用一个结合的金属离子，通常是Zn²⁺，来催化肽键的水解。金属蛋白酶和关节损伤(骨架金属蛋白酶)，血压调节(血管紧张肽转变酶)和肽-激素水平(中性内肽酶-24.11)调节有关。

发明概要

本发明涉及一种分离和纯化的多肽形式的具有生物活性的TNF-α转变酶(“TACE”)。此外，本发明还涉及分离的TACE的核酸序列和包括编码TACE的cDNA的表达载体。本发明还包括被含有编码TACE的cDNA的表达载体转染或转化的宿主细胞，和在诱导TACE表达的条件下培养这些宿主细胞来产生TACE的方法。通过纯化TACE，使针对TACE的抗体，特别是单克隆抗体成为本发明的一方面内容。此外，本发明还包括用TACE来筛选其有效抑制剂的方法和用TACE作为治疗剂来治疗由细胞结合的TNF-α或其它分子介导的疾病。而且，用TACE来设计其抑制剂的方法也是本发明的一个方面内容。

本发明的分离纯化的金属蛋白酶可将26kD膜结合形式的TNF-α转变成17kD形式，其分子量在约66kD至约97kD之间。TACE的cDNA序列列在SEQID NO:1中。分离和纯化的TNF-α转变酶(“TACE”)包括SEQ ID NO:2中的氨基酸18-824。

抑制TACE可抑制TNF-α进入血清和其它胞外空间。因此TACE抑制剂可用于临床治疗以TNF-α过量生成和增量调节生成为特征的状况。适用于某些病理状况的TACE抑制剂可选择性抑制TACE而不影响TNF-β(也称为淋巴毒素)的血清水平。TNF-α过量生成和增量调节生成与某些状况和疾病有关，例如，系统性炎性反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome)、再灌注损伤、心血管疾病、传染性疾病如HIV感染和HIV神经病、妇产科疾病、炎性/自身免疫、过敏/特异反应疾病、恶性肿瘤、移植物包括器官移植物排斥或移植物抗宿主疾病、恶病质、先天性疾病、皮肤疾病、神经疾病、肾病、中毒性和新陈代谢/自发性疾病。