[发明专利]异源基因在细菌细胞中的染色体表达

说明书

                    技术领域

本发明涉及异源基因在细菌中的表达领域。

                    背景技术

遗传工程通过重组表达系统，特别是通过在原核生物(如大肠杆菌(E.coli))中的表达使在细菌细胞中产生大量的异源蛋白或多肽成为可能。

表达的异源兴趣蛋白质可以是哺乳动物、其它真核生物、病毒、细菌、蓝细菌、原细菌或者合成源的。

与天然细菌蛋白不同(其可以在细菌细胞内有效地积累，甚至在由单拷贝的染色体基因编码时)，目前没有报道说明当由单一染色体基因位点编码时异源蛋白可以在细菌细胞中成功地积累超过总细胞蛋白水平的0.1％。

选择总细胞蛋白的0.1％作为蛋白成功积累的实践测量指标是因为：(a)此数值大约是由现代重组细菌产生标准确定的所需要的蛋白有经济价值的明显积累的下限，和(b)此数值大约是考马斯染色的全部细菌细胞抽提物的聚丙烯酰胺凝胶分析中的可见蛋白带的下限。

当非细菌基因在细菌细胞中表达时甚至在已知最强的细菌启动子控制之下表达时，其表现不好一般归因于非细菌mRNA转录不良和新合成的细菌蛋白的迅速降解。广泛接收的观点是为了使非细菌或者异源蛋白在细菌细胞中成功地积累，必须将编码异源蛋白的基因定位在多拷贝的质粒载体中。

一个多拷贝的质粒携带的用于在大肠杆菌中克隆和表达编码异源蛋白的基因的拷贝数通常是每个细胞20个拷贝。甚至低拷贝数的质粒(如pACYC177和pLG339)以每个细胞6-10个拷贝存在。质粒基因剂量的不利一点是甚至一些外源蛋白少量的表达可能杀死宿主细胞(参见酶学方法，185：63-65，D.Goeddel编辑，1990)。因此，在每个细胞的一个或少数几个拷贝上，例如通过将所说的基因整合到细菌染色体上确实限制编码这种有毒基因产物之基因的拷贝数将是有利的。例如，如果所说的文库中高拷贝表达的一个或多个cDNA可能杀死细菌宿主或使之生长不良时，此系统可以使技术人员在细菌宿主中产生多个代表性的cDNA表达文库。

编码异源多肽之基因的染色体整合作为在细菌宿主细胞中表达异源蛋白的方法也是有利的。多拷贝的载体一般是不稳定的，需要在生长培养基中使用抗生素来保持。目前使用的将外源基因整合到细菌染色体上的方法效率低、不能控制外源基因的整合位点和/或不能控制整合的基因的拷贝数。最重要的是，目前所有在细菌染色体上创造重组DNA构建体(其中将细菌启动子融合到异源基因时上)的尝试都和创造携带此构建体的病毒或质粒中间体有关。因为这些中间体以高拷贝数复制，在所说的外源基因产物对这些细菌细胞有毒时它们很难或者不可能恢复。由于这些中间体的高拷贝数(它们使基因的表达水平成倍地增加)，所以编码的基因的表达，甚至在很低的水平时，对宿主细胞也可能是有害的。

以前的把异源基因整合到细菌宿主的染色体上的方法包括使用噬菌体λ载体。在噬菌体附着位点(attP，240个碱基长)和细菌附着位点(attB，仅有25个碱基长)之间通过单一位点的特异重组将环形的噬菌体DNA线性插入到细菌染色体中。这两个位点共有15个碱基对。此位点专一的重组由特殊的整合酶催化，此酶由噬菌体基因INT所限定(病毒学pp.56-57(Lippincott，第二版，R.Dulbecco和H.Ginsberg，编辑，Philadelphia，PA，1985))。

只要在转化过程中提供整合酶，就可以以正常的融合方式，例如通过INT+辅助噬菌体将噬菌体载体INT整合到所说的染色体中(参见，例如Borck等(1976)分子基因遗传学146：199-207)。

同样可以把噬菌体载体att-和INT-作为双溶素原通过使用att+INT+辅助噬菌体整合到细菌染色体上。通过在细菌附着位点上连接原噬菌体形成双溶素原，并通过在缺陷噬菌体和辅助噬菌体的同源序列间的正常细菌重组将其整合到所说的染色体上(例如参见Struhl等(1976)美国科学院学报21：1471-1475)。同样，通过宿主染色体和质粒载体携带的同源序列间的重组也可能将非复制的colE1复制子整合到大肠杆菌PolA菌株的基因组上(Greener和Hill(1980)细菌学杂志144：312-321)。