[发明专利]产生具有正确的折叠和二硫键键合的IGF－I和IGFBP－3的方法

说明书

                      发明领域

本发明总的来说涉及产生有活性的，适当折叠的蛋白质的领域，更具体地说涉及类胰岛素生长因子-I(IGF-I)和类胰岛素生长因子结合蛋白-3多肽的再折叠。

                      发明背景

生长因子是多肽，该多肽在靶细胞的限定种群中刺激产生广泛多样的生物反应(如DNA合成，细胞分裂，特定基因的表达，等等)。多种生长因子已经被人们鉴别，其中包括转化生长因子β1(TGF-β1)、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子-I(IGF-I)和IGF-II。

IGF-I和IGF-II在氨基酸顺序和结构上有联系，每个多肽具有大约7.5千道尔顿(Kd)的分子量。IGF-I调节生长激素的主要作用，因此是出生之后生长的初级调节物。在其它各种生长因子的作用中也已经牵涉了IGF-I，因为用这些生长因子对细胞的处理导致IGF-I产量的增加。相反，人们相信FGF-II在胎生长中是一种主要角色。两者IGF-I和IGF-II都具有类胰岛素活性(并因此得名)，对于在神经组织、肌肉、繁殖组织、骨胳组织和其它广泛的多种组织中的细胞来说，还是促细胞分裂的(刺激细胞分裂)。

与大多数生长因子不同，IGF在循环中大量存在，但这种IGF只有很小的一部分在循环中或其他体液中是游离的。多数循环的IGF与IGF结合蛋白-3结合。人们可以通过在血清中对IGF-I测量来诊断不正常的与生长有关的病症，例如，脑垂体肥大症、顶端肥大症、侏儒症和各种生长激素缺乏症。虽然许多组织都产生IGF-I，但人们相信大多数循环的IGF-I是在肝脏中合成的。

几乎所有的IGF都循环在非共价键联系的由IGF-I或者IGF-II，IGFBP-3组成的三重复合物中，并且其中一个较大的蛋白质亚单位被称为酸不稳定亚单位(ALS)。这个三重复合物是由三种等摩尔量的组分组成的。ALS没有直接的IGF-结合活性并且表现为只与IGF-I或IGFBP-3双重复合物结合。IGF-I+IGFBP-3+ALS的三重复合物具有的分子量约为150Kd。这个三重复合物被认为是在循环中起的功能是“作为IGF-I和IGF-II的储藏器和缓冲带，从而避免游离IGF的浓度的快速变化”(Blum等(1991)“血浆IGFBP-3水平作为临床指示物”，类胰岛素生长因子的现代概念，381-393页，(E.M.Spencer，ed.，Elsevier，纽约)。

多数循环的IGF-I，IGF-II，和IGFBP-3以复合物的形式存在，因此，人们可以探测到的游离IGF是很少的。而且，血液中高水平的游离IGF是不合乎需要的。高的血液IGF水平会由于IGF的类胰岛素活性导致严重的低血糖。与IGF和IGFBP-3相比，在血浆中有一个充足的游离ALS库，从而保证了进入循环的IGF或IGFBP-3复合物立即形成三元复合物。

当IGFBP-3是循环中最丰富的IGF结合蛋白时，人们已经在各种组织和体液中鉴定了至少五个其它性质截然不同的IGF结合蛋白(IGFBPs)。虽然这些蛋白质结合IGF，它们每一个都起源于不同的基因，并具有截然不同的氨基酸序列。因此，结合蛋白不只是一个共有前体的类似物或者衍生物。不同于IGFBP-3，除IGFBP-3以外的其它的循环IGFBP不以IGFs饱和。除IGFBP-3以外，没有IGFBP能形式150Kd的三元复合物。

IGF-I和IGFBP-3可以通过从天然来源纯化或重组方法产生。本领域已知的如，从人类血清中的IGF-I的纯化(Rinderknecht等，(1976)美国科学院学报，73：2365-2369)。在EP 0,128,733中展示了产生IGF-I的重组过程(在1984年十二月出版)。IGFBP-3可以从天然来源纯化，通过用一种方法诸如Baxter等中显示的((1986)“人类血浆中的生长激素-依赖性类胰岛素生长因子(IGF)结合蛋白不同于其它人类IGF结合蛋白，”生物化学及生物物理研究通讯。139：1256-1261)。IGFBP-3可以通过如在Sommer等中(同上，715-728页)讨论的由重组有机体合成。重组体IGFBP-3以1比1的摩尔比率结合IGF-I。