[发明专利]聚氧烃基相关产物和荧光测定方法

说明书

发明领域

本发明涉及分析领域，特别是荧光免疫测定，受体测定和杂交测定。

发明背景

物质的存在或其量的测定通常采用免疫测定法进行。免疫测定技术基于受测抗原物质(“靶分析物”)与靶分析物的受体结合。术语“分析物”或“靶分析物”是指测定中的待测定化合物，它们可以是天然存在的受体或可制备的任何化合物，它们为单一或多表位，抗原或半抗原，单个或多个化合物共有至少一个共同表位部位或受体。免疫测定法适用于多种不同的生物活性物质的测定。这些物质包括半抗原，激素，γ-球蛋白，变应原，病毒，病毒亚基，细菌，毒素如与破伤风和动物毒液有关的毒素，以及众多药物。类似技术可用于带有例如特异性结合蛋白的非免疫系统。

已知本领域有多种不同类型的免疫测定方法，包括竞争性抑制测定法，顺序加入测定法，直接“三明治”测定法，放射变应原吸附测定法，放射免疫吸附测定法和酶联免疫吸附测定法。大多数免疫测定所进行的基本反应是通过特性蛋白(受体)结合某些称作“配体”或“分析物”的物质以形成大分子复合物。这些结合过程是可逆反应，而且对于特定浓度的分析物和受体，复合物形成的程度受质量作用定律的平衡常数控制。因此，在平衡情况下，一些分析物常常处于未结合(游离)状态。

生物液体(如血清，血浆和全血)中的靶分析物的测量需要特异性的而且灵敏的免疫测定法。免疫测定的特异性和灵敏度取决于所涉及的靶分析物和受体之间的相互结合的特性。例如，反应对于待测量的分析物必须是特异性的，而且所用受体不应当与任何其它结构相关的化合物结合。此外，通过选择对靶分析物具有高亲和性的受体，可以增加灵敏度。用于监测测定反应的标记物也影响免疫测定的灵敏度。无论是靶分析物还是受体都可被标记以进行检测。通常用于免疫测定生物液体中靶分析物的标记物包括放射性同位素(放射免疫测定，RIA)，酶(酶免疫测定，EIA)，荧光标记物(荧光免疫测定，FIA)，和化学发光标记物(化学发光免疫测定，CIA)。从理论上来讲，荧光测定法可能是所有分析方法中最灵敏的方法之一，这是由于该方法能检测单光子事件。

FIA使用荧光分子作为标记物，而且可以是异质或均一的。荧光分子(荧光团)是能在某一波长下吸收光并在另一波长处发射光的分子。参见P.Moyer等人的“应用治疗药物检测”(Applied Therapeutic Drug Monitoring)中的“荧光测定——治疗药物测量应用”(Burd，J.F.，“Fluoroimmunoassay--Application to Therapeutic Drug Measurement”)一文，美国临床化学协会(American Association of Clincal Chemistry)(1984)。一般地，将激发脉冲导向样品其上或其内，接着产生样品荧光，并检测荧光辐射。荧光是某些物质所显示的一种现象，当用其它光源照射时，这些物质会发射通常位于可见光范围内的光线。这种现象不属于反射，而是产生新光线。目前商品化的测定方法均使用荧光素，当用含蓝光的光源辐射时，这类物质能发射绿光。除荧光外，荧光素(以及其它荧光团)还发射偏振光。也就是说，如果荧光素分子保持其跃迁距与激发电场平行，则发射光具有和入射偏振光相同的偏振方向。

在竞争性结合免疫测定中使用荧光偏振探针，可以提供一种称为荧光偏振免疫测定(FPIA)的FIA。在这种测定中，分子越小，其旋转弛豫时间就越短，旋转得越快。一般地，抗体分子要远远大于药物或药物一探针分子。偏振技术的优点之一是消除了分离未结合探针的步骤。尽管在FPIA中未结合痕量物实际上不能物理地从样品中除去，但其作用很容易通过偏振化确定。FPIA技术的另一优点是无强度依赖性。大多数利用光测量的测定中，光的强度与药物浓度相关(因此，光源强度的任何变化都将直接影响测定的灵敏度)，但FPIA法则与上述这些方法不同，该方法的灵敏度与强度变化无关。常规的FPIA法需要分别测量空白对照和样品。

困扰荧光免疫测定的难题是从背景辐射中辨别出有用的荧光信号。背景辐射的信号强度可以比有用的荧光信号的强度大10,000倍。背景检测的困难在生物样品测定中特别明显。目前多种荧光测定方法中均使用荧光素这种荧光分子。荧光素具有最大493nm的激发波长，而生物液体中有许多物质具有与荧光素类似的重叠激发和发射波长。例如，在测定血浆时，天然荧光物质胆绿素的存在能造成显著的背景辐射。这类化合物是高荧光性的并产生明显的能干扰标记物信号的背景信号，从而限制了采用荧光素标记物的测定灵敏度。