[发明专利]来自产黄青霉的苯乙酰基CoA连接酶

说明书

本发明涉及用于从青霉素生物合成有关的中间产物进行青霉素合成的酶。本发明还涉及制备该酶的方法和编码该酶的DNA。

在文献(Queener(1990)Antimicrobial Agents andChemotherapy 34(6)，943-948；Martin(1992)J.IndustrialMicrobiol 9，73-90；Luengo(1995)J.Antibiotics 48(11)，1195-1212)中公开了青霉素G的生物化学途径。从增加发酵过程的产率(效价)的角度看，该途径已进行了相当多的研究。

在产黄青霉中，通过连接酶(如PAA-CoA连接酶)，将乙酸苯酯(PAA)和苯氧基乙酸酯(POA)激活形成相应的CoA硫酯。然后用这些硫酯在PAA的情况下生物合成青霉素G，在POA的情况下生物合成青霉素V。因此认为PAA-CoA对于这些有商业价值的治疗用抗生素的生物合成是非常重要的。

一种来自恶臭假单胞菌、具有PAA-CoA连接酶活性的酶已被分离(J.Biol.chem.267(12)7084-7090(1990)，纯化过程包括硫酸铵沉淀和由DEAE-Sephacel柱以氯化钾洗脱。该酶分子量为48+/-1kD，最适pH为8.2，它参与PAA分解代谢。

已经由Kogekar & Deshpande(1983)(Ind.J.Biochem.Biophys20，208-212)和Brunner & Rohr(1975)(Methods Enzymol43，476-481)报道了曾试图用异羟肟酸酯方法(在540nm检测苯乙酰-异羟肟酸酯或苯氧乙酰-异羟肟酸酯的比色法)检测产黄青霉中具有PAA-CoA连接酶活性的酶；但其他研究人员(Martinez-Blanco等(1992)J.Biol.Chem.267(8)，5474-5481)认为该蛋白质不纯或未详细表征其活性。此外，后者不能用报道的方法得到所述酶。

WO96/10085(Gist Brocades，1996年4月4日公开)对这些和其他分离在青霉素途径中起作用的PAA CoA连接酶的努力作了综述。在WO96/10085中提及，从PanLabs(USA)保存的产黄青霉B10菌株中，得到了酰基CoA合酶。该酶所具有的具体特性如下：分子量约50kDa(由凝胶过滤确定的)，最适pH为8到8.5(在pH7或以下，活性低)，最佳温度为40℃，pI高于7.25。重要的是，通过硫酸铵沉淀可纯化该酶。它具有相当宽的特异性(即，它可以催化从Mg²⁺、ATP、CoASH和苯氧乙酸、苯乙酸、己二酸或己酸形成相应的苯氧乙酰CoA、苯乙酰CoA、己二酰CoA和己酰CoA)，但对乙酸没有任何显著的活性。据说该酶还可通过还原剂来稳定。高浓度的硫酸铵或甘油也可稳定该酶。对于用公开的方法得到的酶活性没有任何纯度说明，尚未给出该酶的序列或N-末端序列，也未给出相应的DNA或其序列。

尽管进行了这些努力，但对在青霉属体内起作用的真正PAA-CoA连接酶仍了解得很少。已经推测，该酶可能与初级代谢有关(Smith等(1990)Biotechnology 8，39-41)。Martinez-Blanco等(1992)(出处同上)筛选了一种可能的候选酶，乙酰CoA合酶，在乙酰CoA合酶活性的基础上，从产黄青霉中纯化该酶。它们除可形成乙酸酯的CoA衍生物外，还可体外激活数种脂肪酸(C2-C8)和一些芳族分子(包括PAA)。

已经测定了乙酰CoA合酶基因(国际专利WO92/07079，Gouka等(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.38，514-519，Martinez-Blanco等(1993)Gene 130，265-270)，并表明与其他真菌的乙酰CoA合酶有同源性。但用氟乙酸筛选的该基因中的突变似乎并未改变青霉素生产水平(国际专利WO92/07079)，这说明实际上体内的另一种酶激活了PAA。