[发明专利]受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统

说明书

本发明涉及一种通过微生物制造重组蛋白质的大肠杆菌外源基因表达系统，属于生物工程领域。

大肠杆菌外源基因表达系统是基因工程疫苗，药物，动植物生长因子和工具酶等生物技术产品研究开发的关键技术之一。由于其遗传背景清楚，大部分基因元件的结构功能明确，对培养操作的外部条件宽容度大，因此该系统往往成为基因工程项目研究和生产的首选系统。目前已有不同调控模式的大肠杆菌外源基因表达系统问世：可归纳为[1]采用Lac，Tac启动子构建表达系统，其基因表达受乳糖及其类似物诱导。[2]采用λ噬菌体的P_L、P_R启动子构建表达系统，其基因表达受cI蛋白抑制，在温度敏感突变体cI857存在的条件下，其基因表达受温度调控。[3]采用Trp启动子构建表达系统，其基因表达受环境中低色氨酸浓度诱导。[4]采用SP6、T₇噬菌体的SP6、T₇启动子构建表达系统，由Lac启动子控制SP6或T₇ RNA聚合酶的表达，其基因表达受乳糖及其类似物诱导。这些大肠杆菌外源基因表达系统一般适用于小规模制备重组蛋白质，当应用于大规模生产重组蛋白质时。化学信号诱导调控模式的缺陷是生产成本高，温度调控模式的缺陷是传热速度不能达到工艺要求。本发明的目的是建立一种受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统，并且这种表达系统能适用于大体积高密度发酵并能应用于大量的重组蛋白质生产。

本发明采用透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)的启动子元件来达到发明目的，Vgb基因在大肠杆菌细胞内具有功能作用，其转录过程受高氧浓度抑制，在贫氧条件下被诱导。用Vgb基因的启动子直接控制外源基因虽然可实现由环境溶氧浓度来调控基因表达，但Vgb基因的启动子在大肠杆菌细胞内强度较弱，外源基因表达水平较低，应用价值不大。所以本发明的技术方案是构建一种用Vgb基因的启动子控制T₇ RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒和另一个由T₇启动子控制表达外源基因的高拷贝质粒。通过DNA转化技术使二种质粒稳定地存在于大肠杆菌细胞内。构建成的外源基因表达系统在调控模式上遵循Vgb基因启动子的规律，在外源基因的表达水平上与现有表达系统的最高水平相当，因此有很大的应用前景。

在以下内容中对发明的实现过程作进一步的详细描述：1.化学合成寡聚核苷酸A和B，A序列为5′GAGGCCCTTTCGTCTTCAAG3′B序列为5′TTGCTGGTCTAACATGAGGGT3′。以寡聚核苷酸A和B为引物，含Vgb基因的质粒pBR322-Vgb为模板，在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下得到大小为207bp的DNA扩增片段，该片段中含有Vgb基因的启动子。用限制性内切酶Hind III，Afl II酶解、Mungbean核酸酶处理该DNA片段后将其插入质粒pKK232-8的Sma I位点，得到质粒pKK-Pro。2.化学合成寡聚核苷酸C和D。C序列为5′TCAGGATCCAGGAGGACTAAATGAACACGATTAACATCGCTAAG3′，D序列为5′GCTGAAGCTTTTACGCGAACGCGAAGTCCGACT3′。以寡聚核苷酸C和D为引物，含T₇RNA聚合酶基因的噬菌体l(CE6)DNA为模板，在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下得到大小为2.7Kb的DNA扩增片段，该片段中含有完整的T₇RNA聚合酶基因。用限制性内切酶BamH I，Hind III，酶解该DNA片段后将其插入质粒pKK-Pro的BamH I，Hind III位点，得到质粒pKK-T。3.用限制性内切酶Hind III酶解质粒pKK-T，Klemow酶补平粘端，再用限制性内切酶EcoR I酶解，琼脂糖凝胶电泳分离2.9Kb的DNA片段，该片段包含有在Vgb基因的启动子控制下的T₇RNA聚合酶基因，将其插入低拷贝质粒pWSK129的EcoR I，EcoR V位点，得到质粒pTQ107。4.通过DNA转化技术将质粒pTQ107转化大肠杆菌菌株BL21。得到能受环境溶氧浓度调控，高水平表达外源基因的基因工程菌GJ100。

以下为本发明的实施于表达原核、真核生物外源基因的例子：