[发明专利]人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法

权利要求书

1.一种人肿瘤坏死因子α衍生物Db，其特征在于：hTNFαDb是由两个衍生物拼接而成，它的N端来自hTNFα61，即hTNFα原型中缺失7个氨基酸是^#1-^#7；C端来自CG-TNFα，是hTNFα原型中缺失6个氨基酸是^#102-^#107，hTNFαDb由145个氨基酸组成，包括第一个甲硫氨酸，比hTNFα原型少13个氨基酸。

2.一种人肿瘤坏死因子α衍生物Db的制备方法，包括CG-hTNFα的构建，hTNFα61的构建和hTNFαDb的克隆，其特征在于：

1)CG-hTNFα的构建

从人基因组文库中分离出hTNFα基因，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，作为PCR扩增CG-hTNFαcDNA的模板；PCR引物设计为：第一对引物：

N端  5’GGCCATATGGTTGGTTCTTCTTCTCGTA 3’引物1

28mer        NdeI

C端  5’GCAGGGGCTCTTGATGGC  3’  引物2

18mer第二对引物：

N端  5’GGGGCTGAGGCCAAGCCC  3’  引物3

18mer

C端  5’CGGAATTCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG 3’

30mer      EcoRI              引物4

2)hTNFα61的构建

以hTNFαcDNA为模板，设计相应的PCR引物，得到的PCR扩增产物即为hTNFα61cDNA；PCR引物设计为：N端引物：5’GCCATATGCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA 3’31mer         NdeIC端引物：5’CCGGAATTCTCAGAAGGCAATGATCCCAAAGTA 3’33mer          EcoRI将PCR扩增产物用NdeI和EcoRI完全酶切后，与载体pRSETc连接；

3)hTNFαDb的克隆

用HincII和EcoRI从pCG-hTNFα表达质粒中分离出带缺失^#102-^#107的CG-hTNFα的C端部分，取代pRSETc-hTNFα61的相应部位，建成pRSET-hTNFαDb的表达质粒；

4)hTNFαDb的发酵、分离纯化。

3.根据权利要求2所述的人肿瘤坏死因子α衍生物Db的制备方法，其特征在于工程菌的发酵分离纯化的更好条件是：

1)工程菌单菌落活化后接种LB培养液，30-38℃振荡培养8-12小时，继续扩大培养2.0-4.0小时，加IPTG至终浓度0.001-1.0mM，继续培养3-6小时，离心收集菌体；

2)菌体沉淀超声破碎后离心，上清液加固体硫酸铵40-60％饱和度，离心收集沉淀，沉淀经柱层析脱盐，再经离子交换层析柱分离，分离时用含盐浓度梯度0.05-1.0M的缓冲液洗脱，收集含盐的洗脱液。