[发明专利]人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法

说明书

本发明涉及人肿瘤坏死因子α(TNFα)衍生物的构建及其生物工程制备方法。

TNFα主要由激活的巨噬细胞产生的一种细胞因子，它能直接杀伤某些体外培养的肿瘤细胞和病毒感染细胞，使体内一些肿瘤发生出血性坏死。自1984年用生物工程技术获得重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)以后。在肿瘤病人系统给予rhTNFα临床试验中发现，在有疗效的剂量范围内会出现毒副反应。为克服rhTNFα的毒副作用，人们在局部给药、复合用药和对hTNFα结构改造提高活性降低毒副作用两方面作了不懈的努力。1996年3月在TNF和相关细胞因子临床应用和生物学功能国际会议上，瑞典、荷兰和美国的几个研究组报道rhTNFα+IFNγ+melphalan通过局部灌注治疗300多例四肢恶性黑色素瘤、软组织肉瘤患者治愈率达80％以上，rhTNFα用量高达3-4毫克/肢体也未出现毒性死亡，为rhTNFα临床使用另辟蹊径。自八十年代以来，构建高效低毒rhTNFα衍生物的努力一直没有停止过。最近有报道TNFα和淋巴毒素(LTα或TNFβ)能诱导正常细胞和动物产生锰过氧化物歧化酶，保护它们免受辐射或肿瘤化疗药物的损伤；诱导蛋白酶产生杀伤肿瘤细胞。因此，抑瘤谱范围广，细胞毒活性高的人肿瘤坏死因子衍生物是一种前景看好的肿瘤治疗药物。hTNFαDa是近年来构建的新型肿瘤坏死因子衍生物，它的中国专利申请号为94112172.0。hTNFαDa的细胞毒活性比rhTNFα提高一个数量级，而毒副作用降低一个数量级以上，是一个很有应用前景的衍生物。但对hTNFαDa的理化性质分析及稳定性试验过程中，发现它的热稳定性比原型差。hTNFαDa的不足和衍生物a的C端由原来的Leu改为Phe有关，因为有报道认为第157位的Leu与第14位的Ala之间有氢键存在。

本发明的目的是构建一个提高细胞毒活性、扩大抑瘤谱范围、稳定性好的人肿瘤坏死因子α。

本发明在构建hTNFαDb时我们维持C端部分不变。TNFα和LTα是在结构和功能上非常相似的两个细胞因子，它们结合同样的受体行使其细胞毒活性，但比较LTα和TNFα单体的立体结构图，可发现TNFα顶端突出的环(^#101-^#113)比LTα近似位置的环(^#84-^#89)整整多出7个氨基酸。当LTα缺失这六个氨基酸时可大大提高细胞毒活性。TNFα^#102-^#107平均亲水性是TNFα分子中亲水性最高的三个部位之一。在TNFα^#102-^#107中引入缺失对TNFα的细胞毒活性有提高。1994年比利时的R.Lucas等实验证明TNFα^#101-^#113结构类似lectin，对某些多糖分子有亲和性，与裂解寄生虫(Salivarian锥虫)有关。这段多肽与肿瘤细胞杀伤与毒副作用有何关系有待进一步研究。本发明据此构建了hTNFαDb。人肿瘤坏死因子α衍生物有多种，本发明的衍生物命名为b，即hTNFαDb。它的N端来自hTNFα61，即hTNFα原型中缺失^#1-^#7共7个氨基酸，C端来自CG-hTNFα，即hTNFα原型中缺失^#102-^#107共6个氨基酸，hTNFαDb由145个氨基酸组成，包括第一个甲硫氨酸，比hTNFα原型少13个氨基酸。

hTNFαDb的克隆过程如下：

1)CG-hTNFα的构建

从人基因组文库中分离出hTNFα基因，切出第4外显子，接上人工合成寡聚核苷酸片断，组装成hTNFαcDNA，作为PCR扩增CG-hTNFαcDNA的模板。PCR引物设计为：第一对引物：

N端  5’GGCCATATGGTTGGTTCTTCTTCTCGTA  3’(primer1)

(28mer)    NdeI

C端  5’GCAGGGGCTCTTGATGGC  3’(primer2)

(18mer)第二对引物：

N端  5’GGGGCTGAGGCCAAGCCC  3’(primer3)

(18mer)

C端  5’CGGAATTCTCACAGGGCAATGATCCCAAAG 3’